séquençage de l'ADN Flashcards
à quoi sert le séquençage? 5
- Structure des génomes et phylogénie
- Déterminer la structure d’un gène et possiblement sa fonction
- Détecter les polymorphismes
- Analyser les variations génétiques
- Prédire les produits possibles de fragments d’ADN
quelles sont les 2 premières méthodes de séquençage
- Méthode chimique ou…« Maxam-Gilbert »
* Méthode enzymatique ou…« Sanger »
Combien coûte le séquençage de 10^6 paires de bases en
- 2001
- 2011
- 5000$
- 0.50$
Quels sont les étapes de la méthode chimique avant la purification sur gel? 4
-digestion de l’ADN (plasmide)
-déphosphoryler bout 5’(phosphatase)
-kinaser extrémités 5’ avec γ 32P ATP
-après marquage, recouper avec une 2e enzyme de restriction, pour alors n’avoir
qu’un seul brin marqué au γ 32P
Quel étape permettera de séquencer l’ADN dans la méthode chimique?
- fragment radioactif divisé en 4 tubes+ l’hydrolyse chimique spécifique pour chacun des 4 nucléotides
- hydrolyse partielle et limitée du fragment à des sites spécifiques
Quels étaient les défaults de le méthode chimique
capricieux: sensible à la fraicheur et puretéd es réactifs
- la résolution ne permet de se rendree plus loins que 300 nt du site de marquage
Sur quoi est basé la méthode enzymatique?
l’interruption d’élongation de la DNA polymerase lorsque l’enzyme
est en présence de di-déoxynucleotide (rien ne peut être ajouté en 3’)
Avec quoi fait-on le marquage de l’ADN dans la méthode enzymatique
35S-> signaux moins puissants mais permet une meilleur résolution
que sont les amorces univrselles?
extension d’amorce, dont l’extension ou élongation est
interrompue suite à l’incorporation d’un ddNTP; l’amorce peut être interne
à l’insert d’ADN à séquencer ou alors, du vecteur de clonage dans lequel se
trouve l’insert
À quoi a permis l’ajout de fluorochromes couplés au nucléotides? 2
1- électrophorèse en continu (plus grande distance et plus grande résolution)
2- se fait dans 1 tube (couleurs des fluorochromes
permet de distinguer de quel nucléotide il s’agit pour une chaîne dont
l’élongation est interrompue)
à quoi sert l’extension d”amorce?
Permet de délimiter la région promoteur d’un gène et donc, d’en caractériser
les régions régulatrices
pourquoi caractériser un promoteur?
-expression d’un gène régulé selon le tissu, selon l’âge, etc…
d’en connaître les composantes peut permettre d’identifier ce qui cause
une pathologie due à l’expression ectopique d’un gène
peut permettre de forcer l’expression tissu-spécifique d’un transgène
régulation de l’expression génique peut se faire aussi au niveau de la région 5’ non
codante d’un mRNA, et c’est la technique idéale pour la localiser
Comment fait-on un extension d’amorce
Par réverse transcriptase d’un ARNm, l’extrémité 5’=site d’initiation du promotteur
