Incubazione in giara, conservazione e mantenimento colonie, conteggio microbico metodi diretti ed indiretti. carica batterica totale di un campione di latte. Flashcards
che cos’è una giara e per cosa viene utilizzata
-una giara per anaerobiosi o GasPack è un sistema per anaerobiosi a chiusura ermetica utilizzato per incubare colture di microrganismi anaerobi
che cosa c’è dentro alla giara e come funziona
la giara contiene:
-un pezzo di carta assorbente imbevuto di un indicatore redox (blu di metilene o resazurina)
-una busta per anaerobiosi, contenente SODIO BICARBONATO e SODIO BOROIDRURO
All’interno della busta si vanno a mettere pochi mL d’acqua e poi si chiude ermeticamente la giara.
All’interno della giara avverrà una reazione, catalizzata dal palladio presente nel coperchio, che produrrà idrogeno, che lega l’ossigeno e forma l’acqua, e CO2.
descrizione del Clostridium sporogenes
sono bacilli anaerobi obbligati Gram+, che formano spore se le condizioni ambientali diventano avverse.
che terreno abbiamo utilizzato per coltivare il clostridium e che colonie si formano
abbiamo utilizzato il terreno SPS Agar, un terreno selettivo che contiene POLIMIXINA B SOLFATO e SULFADIAZINA: i clostridium trasformano il solfito in solfuro che reagisce con gli ioni ferro formando un precipitato nero di solfuro di ferro.
le colonie quindi saranno nere.
procedimento per incubazione in giara
-posizionare in una piastra 12mL di terreno, lasciare solidificare e seminare per strisciamento il clostridium
-aggiungere altri mL di terreno per effettuare la semina a sandwich
-incubare in giara le piastre petri capovolte e metterla in incubatore a 37°C
come creare una coltura pura
per creare una coltura pura (con microrganismi dello stesso tipo e derivanti dalla stessa cellula) bisogna prima creare delle colonie isolanti: in delle piastre si semina un piccola quantità di microrganismi così da creare delle colonie isolate.
Ognuna di queste colonie isolanti viene poi seminata in un’altra piastra con un terreno adatto.
perchè conserviamo le colture e cosa vuol dire conservare
le conserviamo per poterle impiegare ripetutamente.
conservare vuol dire mantenerle pure, cioè prive di variazioni genotipiche o fenotipiche
come si conservano le colture
di solito le colture si conservano in frigorifero a -4°C. ma possono essere conservate per brevi periodi.
le tecniche più utilizzate per conservare le colonie sono:
-trasferimento periodico in terreno di coltura fresco: le colture vengono traferite in un terreno di coltura nuovo ma uguale a quello precedente
-conservazione sotto olio minerale sterile: si utilizza la paraffina per non far disidratare i terreni solidi in provetta
-liofilizzazione: è un congelamento a secco a -54/-72 sotto vuoto per eliminare l’acqua. Possono essere conservate per anni e possono essere riutilizzate reidratandole.
-congelamento a temperature molto basse: viene aggiunta la glicerina e si portano le colture a temperature di -50/-95 o in azoto liquido fino a -196. si possono conservare per anni.
differenza tra metodi per determinare la carica microbica diretti e indiretti
DIRETTI: servono a contare il numero di cellule presenti in volumi noti del campione. Sono i meno utilizzati perchè contano anche le cellule morte
INDIRETTI: vengono contate le colonie che si sviluppano all’interno di un terreno di coltura dopo la semina di quantità note di campione. Sono i + utilizzati perchè contano solo le cellule vive, ovvero che riescono a riprodursi.
perchè e come si allestisce una diluizione
le diluizioni servono a impedire al campione di creare ammassi e colonie troppo ravvicinate, quindi aiuta ad effettuare il conteggio.
la prima fase della diluizione spesso è l’omogeneizzazione: 10mL di campione in 90mL (diluizione 1:10) di diluente (soluzione salina o di ringer) vengono inseriti nello stomacher.
si iniziano poi le diluizioni normali:
-1mL della slz omogeneizzata in 9mL di diluente per una diluizione 1:100
-1mL della slz 1:100 in 9mL di diluente per una diluizione 1:100
…
che cos’è una camera contacellule
una camera contacellule è un metodo diretto per determinare la carica microbica.
è un vetrino che presenta un reticolo inciso (i più noti sono quelli di Thoma-Zeiss e di Burker): tra il vetrino e il coprioggetto si forma uno spazio dove si fa entrare per capillarità il campione.
le cellule vengono poi contate al microscopio ottico
che cos’è un contatore automatico
un contatore automatico è un metodo diretto per determinare la carica microbica.
il campione passa in un capillare piccolissimo e le cellule passano ad una ad una, questo capillare è posto tra due elettrodi e il passaggio di ogni cellula interrompe il circuito che viene trasformato da un sensore in un valore numerico.
metodo indiretto che abbiamo utilizzato per contare le colonie
-creare delle diluizioni
-per ogni diluizione fare 2 piastre
-contare le colonie presenti sulla piastra e tenere in considerazione solo quelle che sono tra 30 e 300
-poi faccio il numero delle colonie per il fattore di diluizione
-sommo tutti i calcoli che faccio e poi divido questo numero per il numero di piastre che ho tenuto in considerazione (lo esprimo in UFC unità formanti colonie)
cos’è il metodo delle membrane filtranti
viene utilizzato il metodo delle membrane filtranti per filtrare un campione, così da far rimanere sulla membrana i microrganismi.
il filtro verrà poi messo sopra a un terreno di coltura per far sì che le sostanze nutritive raggiungano i microrganismi all’interno del filtro.
si svilupperanno delle colonie che possono essere contate
che cos’è il metodo MPN
è una tecnica indiretta basata sul MOST PROBABLE NUMBER di microrganismi all’interno di un terreno liquido.
-si preparano 3 serie da 3 provette ciascuna con 9mL di diluente e mL di campione ciascuna (1mL 0,1 mL 0,01mL)
-se nella prima serie avviene la crescita in 2, nella seconda in 3 e nella terza in 0 dobbiamo prendere il numero 230 che viene utilizzato per risalire al numero più probabile di microrganismi grazie a delle tabelle
