AGIRE SUL DNA: LE MICROBIOLOGIE Flashcards
Definizione di biotecnologia
la biotecnologia è un insieme di scienze che si occupano delle tecnologie che utilizzano degli organismi viventi o delle molecole che producono per scopi agroalimentari, farmacologici e diagnostici per migliorare le condizioni di vita
che cosa sono le biotecnologie tradizionali
si tratta delle prime applicazioni di biotecnologie, quando ancora non si sapeva che si stavano utilizzando dei microrganismi, e sono ad esempio la produzione di alcool etilico a opera dei lieviti per bevande alcoliche e pane e la fermentazione del latte da parte dei lactobacilli per yogurt e formaggi.
vengono anche utilizzate per la selezione di animali e vegetali, per scegliere quelli più produttivi e adatti all’ambiente
scoperte importanti del 1900
1928 Fleming scopre la penicillina da una muffa del pane (il penicillum)
1952 Hersey e Chase capiscono che il materiale genetico è costituito da DNA
1953 watson e crick capiscono che il DNA ha una struttura a doppia elica
vie per ottenere un gene di interesse
ci sono 4 vie:
-ISOLARLO NELLA CELLULA CON DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE è molto costoso e richiede molto tempo
-RETROTRASCRIVERLO A PARTIRE DALL’MRNA a partire dal mRNA, che deve codificare per la proteina ricercata, viene utilizzata la TRASCRITTASI INVERSA per sintetizzare una sequenza di DNA a singolo filamento. Viene poi utilizzata la DNA POLIMERASI per creare una catena complementare a quest’ultima così da formare DNA a doppio filamento, che rappresenta il gene ricercato.
-RICAVARLO DA UN FRAMMENTO DI DNA E DUPLICARLO CON PCR
-CREARLO PER SINTESI CHIMICA utilizzo la sintesi chimica per unire tutti i nucleotidi che formano il mio gene di interesse, è una pratica difficile e costosa
che cosa sono gli enzimi di restrizione
sono degli enzimi che vengono prodotti dai batteri per proteggersi dai virus batteriofagi, perchè vanno a disattivare il genoma virale tagliandolo in sequenze più piccole
nelle biotecnologie vengono utilizzati per tagliare il DNA in sequenze più piccole e per isolare i geni di interesse
sono delle vere e proprie forbici molecolari che vanno a tagliare il DNA tra il gruppo ossidrile nell’estremità 3’ e il gruppo fosfato nell’estremità 5’, in sequenze specifiche chiamate SITI DI RESTRIZIONE, che spesso sono palindrome
come vengono nominati gli enzimi di restrizione
gli enzimi di restrizione vengono riconosciuti grazie a delle sigle formate da:
-batterio di provenienza
-ceppo batterico particolare
-successione temporale di scoperta dell’enzima
ad esempio EcoRI proviene dal batterio Escherichia Coli ed è stato il primo ad essere scoperto
in che modo possono tagliare gli enzimi di restrizione
possono tagliare in due modi:
-IN MODO SIMMETRICO tagliando al centro della sequenza e producendo delle estremità piatte (blunt ends)
-IN MODO ASIMMETRICO tagliando in modo sfalsato e producendo delle estremità appiccicose (sticky ends)
che cosa utilizziamo per separare i frammenti di DNA
l’elettroforesi su gel
come funziona l’elettroforesi
l’elettroforesi va a separare i frammenti di DNA sfruttando il gruppo fosfato carico negativamente che quindi migrerà verso il polo positivo
all’interno della camera per elettroforesi è presente:
-una matrice di gel di agarosio, che presenta dei pozzetti che verranno caricati con il campione di DNA
-una slz salina per far sì che il flusso della corrente sia continuo
che cosa sono e a cosa servono le sonde molecolari
le sonde molecolari sono dei frammenti specifici di DNA o RNA marcati radioattivamente utilizzati per andare a localizzare un gene di interesse, perchè si legano solo ai tratti di DNA bersaglio che hanno sequenze complementari
che cosa utilizziamo per inserire il DNA esogeno in delle cellule ospiti
utilizziamo i vettori, che sono degli elementi genetici extracromosomici che possono trasportare DNA esogeno e mantenerlo stabile nella cellula ospite
caratteristiche dei vettori
i vettori devono:
-penetrare facilmente all’interno della cellula ospite
-essere stabili e compatibili con la cellula ospite
-replicarsi in modo autonomo rispetto al genoma della cellula ospite
-possedere siti di restrizione unici per ogni enzima di restrizione così da essere tagliato in un unico punto
-possedere dei geni marcatori così da riconoscere le cellule trasformate e ricombinanti (in genere vengono utilizzati i geni marcatori per la resistenza agli antibiotici)
che cosa sono i plasmidi
sono delle molecole circolari di DNA extracromosomico a doppio filamento, sono presenti naturalmente in alcune cellule batteriche e di lievito ma non sono indispensabili per la sopravvivenza della cellula, conferiscono però delle caratteristiche in più (resistenza agli antibiotici)
caratteristiche e svantaggi dei plasmidi
i plasmidi sono i vettori più utilizzati perchè:
-sono di piccole dimensioni
-possono essere presenti all’interno della cellula in numerose copie
-presentano un punto ORI (si duplicano autonomamente)
essendo piccoli però non possono ospitare frammenti più grandi di 10.000 nucleotidi
che cosa deve avere un plasmide
un plasmide deve:
-possedere un sito di restrizione unico, chiamato POLYLINKER, così da essere tagliato in un solo punto durante l’inserimento del DNA esogeno e non interrompere dei geni indispensabili per il plasmide
-deve disporre di geni marcatori che facciano riconoscere quali plasmidi sono ricombinanti e quali cellule hanno assorbito il plasmide ricombinato.
Spesso questi geni sono geni di resistenza gli antibiotici, così che basti far crescere le cellule in un terreno che presenta l’antibiotico per selezionare quelle resistenti.
un esempio di questi plasmidi è il pBR322 che è il primo plasmide artificiale, che presenta:
-un punto ori
-un sito polylinker
-un gene per la resistenza all’ampicillina
-un gene per la resistenza alla tetraciclina
