immunobolt 1 Flashcards
but immunobolt
donner des info sur les proteine, detecter des proteine
ckoi electrophorese
L’électrophorèse fait référence à la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique.
.
cmt les particule migre ds le gel de l lectrophorese et prk
Puisqu’on utilise une matrice de migration nonhomogène (le gel de polyacrylamide) et qu’on homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution, celles-ci migreront dans le gel en
fonction de leur poids moléculai
SDS-^page ckoi
on utilise une matrice de migration nonhomogène (le gel de polyacrylamide) et ensuite on l’homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution,
apre la resolution des proteine sur le SDS-page keski est possible de faire
il est possible de les transférer sur une membrane, afin de permettre leur détection immunologique.
immunoblot c kel deu technic
c gel sds-page et membrane
le gel polyacrilamide c une tevh ki repose sur koi
Cette technique repose sur la polymérisation de monomères d’acrylamide,
qui sont reliés entre-eux par l’incorporation de co-monomères bi-fonctionnels de
bisacrylamide,
créant ainsi un tamis tri-dimensionnel à travers duquel les protéines migreront.
Les concentrations d’acrylamide et de bisacrylamide dictent
respectivemen koi
t la longueur des chaînes d’acrylamide et l’étendue de leur réticulation.
En pratique, on exprime la concentration de polyacrylamide sous la forme
%T, %C,
T et C represente koi
ù T représente la concentration totale de monomère (acrylamide + bisacrylamide)
et C, le pourcentage de monomère T totaux provenant de la bisacrylamide.
les concentration de acrylamide et bisacrylamide influence koi
Ces concentrations influencent la densité, l’élasticité, la force mécanique et la taille des pores du gel.
il est donc relativement aisé de modifier la taille des pores du
gel en modifiant
les proportions d’acrylamide et bisacrylamide contenues dans le gel.
La polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide est initiée par
des catalyseurs, soit le persulfate d’ammonium (APS) et le TEMED.
APS vs TEMED diff
Les radicaux libres du APS
catalysent la polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide,
tandis que le TEMED accélère le taux de formation de radicaux libres du APS
La propriété
hygroscopique du APS cause
sa dégradation presqu’immédiatement au contact de l’eau, ce qui justifie sa préparation extemporanée (préparation fraîche)
des sol a kel temp on doi utiliser lors de l lectrophorese
Lors de la préparation d’un gel d’électrophorèse, on devrait toujours utiliser des solutions à température de la pièce, préparées avec de l’eau distillée ou désionisée
et dégazées. L
La polymérisation d’un gel de polyacrylamide est un processus cmt
exothermique, qui peut être influencé par la température ambiante et l’oxygène
atmosphérique
temp de polymerisation
Bien qu’après 15-20 minutes le mélange ait commencé à gélifier, la polymérisation se poursuit pendant environ 2 heures
Le pourcentage d’acrylamide utilisé pour la confection du gel est dicté par
r la taille des protéines de l’échantillon.
La mobilité relative (R ) des protéines dans le gel est cmt
inversement proportionnelle au logarithme de leur poids moléculaire (M )
on doit choisir un pourcentage d’acrylamide qui permettra à la protéine d’intérêt de
1-migrer au moins jusqu’au tiers du gel dans le temps requis pour que le front de migration atteigne le bas du gel.
2-qui permette la manipulation du gel une fois l’électrophorèse terminée,
3-ainsi que le transfert efficace des protéines vers une membrane, afin de
procéder à l’immunoblot.
. En règle générale, plus le pourcentage d’acrylamide est faible et que le gel est mince, plus
le transfert sera efficace
un gel trp mince sera facilemen manipulable
fau . Par contre, un gel trop
mince sera difficilement manipulable.
SDS CKI
un puissant dénaturant de protéines. Il s’agit d’un détergent anionique
role SDS
ui permet, d’une part,
-de solubiliser les protéines de l’échantillon,
-et d’autre part, d’appliquer une charge négative constante par unité de masse,
— en s’enrobant autour de la structure du polypeptide.
tous les polypeptides liés au SDS possèdent
t la même conformation hydrodynamique et la même charge, leur conférant ainsi le même potentiel électrophorétique, à
l’exception de leur taille moléculaire. L
L’ajout du 2-mercaptoéthanol, couplé au chauffage des échantillons, perme
t la réduction des ponts disulfures et la dissociation
des polypeptides, ce qui « ouvre » leur conformation et permet la liaison complète du SDS sur ceux-ci. D
Dans la méthode Laemmli, on coule u
un gel de compactage
au-dessus du gel de séparation, ce qui permet à l’échantillon de se compacter et se concentrer avant de pénétrer dans le gel de séparation,
ce qui améliore ensuite
la résolution et la séparation des polypeptides lors de la migration.
keskon doi faire o proteine avan leur chargement
Il est très important de doser les protéines avant leur chargement dans les puits. E
le chargement de plus de 30 µg de protéines totales/mm créera un
a un effet de distorsion et pour une protéine particulière, cette limite ne devrait pas excéder 0,3
µg/mm .
Pour faciliter le chargement des échantillons dans les puits, on ajoute habituellemen koi
ne faible quantité de glycérol et de bleu de bromophénol dans le tampon
réducteur.
glycerol ajouté fai koi
Le glycérol augmente la densité de l’échantillon, ce qui facilite son chargement dans les puits
coloration permet koi
t la coloration permet de suivre l’évolution de la migration,
en plus de permettre le calcul du R des protéines (la mobilité d’une protéine divisée par la mobilité du front de migration)
ki migre plus rapidemen ke tout les otre molecule
Puisque le bleu de bromophénol est une
très petite molécule anionique, elle migrera plus rapidement que toutes les autres, formant ainsi le front de migration.
Une fois la migration des protéines terminées, tel que déterminé par la position du front de migration, keskon fai
on peut colorer le gel pour les visualiser ou les transférer surune membrane de PVDF (polyfluorure de vinylidène) pour les détecter immunologiquement. Toutefois, on ne peut faire les deux avec le même échantillon. Si on doit
faire les deux techniques avec un même échantillon, il faut prévoir le charger dans deux puits, un pour chaque technique
Pour la coloration des protéines sur le gel, on utilise
une solution de bleu de Coomassie R250
cmb de volume de coloration on doi use
- On doit utiliser 10X le volume du gel pour la coloration, afin de s’assurer
de diluer le SDS qui pourrait faire compétition aux protéines pour la liaison au colorant.
e. L’éthanol 40%, l’acide acétique 10% et l’eau distillée 50% contenus dans la solution de coloration causent
t la précipitation des
protéines dans le gel, afin d’éviter leur fuite du gel vers la solution de coloration
t. La sensibilité de cette méthode de détection est
d’environ 1 µg de protéine et
la coloration est non-réversible.
Le transfert des protéines sur une membrane de PVDF se fait cmt
également par application d’une charge électrique.
imp de manipuler la mbr cmt
Il est très important de toujours manipuler la
membrane à l’aide de pinces et de toujours porter des gants
prk gan kd on manipule mbr
. Les huiles de la peau empêchent le mouillage adéquat de la membrane et les protéines à la surface de
la peau se fixent à la membrane
mbr proteger par koi
pour cette raison, la membrane est protégée entre deux feuilles de papier bleu jusqu’à son utilisation. On la manipule donc toujours
avec des pinces, en limitant au maximum la surface de contact.
cmb de proteine peuve se fixer sur mbr
Environ 150 µg de protéines peuvent se fixer par cm de membrane de PVDF qui possède des pores de 0,2 µm
cmt doi etre la membrane avan son utilsation
. La membrane de PVDF doit être activée avant sonutilisation : on la mouille tout d’abord dans de l’alcool 100% avant de l’équilibrer dans le tampon de transfert.
Le gel de polyacrylamide et la membrane de PVDF sont
ensuite mis cmt
en sandwich entre deux papiers absorbants pour ensuite être placés entre une anode et une cathode dans le module de transfert.
Les protéines,
chargées négativement par le SDS, sont attirées vers
’anode (électrode positive
donc proteine de gel face a mbr + charge fon koi
). Elles quittent donc le gel et sont arrêtées par la membrane de PVDF, où elles se
lient par des interactions hydrophobes.
Sur la membrane, contrairement au gel de polyacrylamide, il est possible de m
e marquer les protéines totales, aussi bien que des protéines particulières, et ce à l’aide
d’anticorps spécifiques.
par kel deu methode on marque les proteine total
-La première, la coloration au Ponceau S, est
réversible. L
-e. La
deuxième est la coloration à la NHS-biotine.
coloration panceau s c cmt
Le colorant se fixe aux régions non-polaires des protéines et sert dans notre protocole à vérifier l’efficacité du transfert des protéines sur la membrane
cmt on fai coloration NHS biotine
- On incube d’abord la membrane avec la NHS-biotine.
- On ajoute ensuite la streptavidine couplé à la peroxydase de raifort (HRP).
- On termine avec l’ajout du substrat (luminol), qui mène à la réaction de chemiluminescence, détectable avec le système Amersham Imager, équipé d’une caméra
CCD.
La NHS-biotine se fixe de façon irréversible a ki
aux résidus lysines ou au N-terminus des polypeptides qui ont migrés dans le gel et qui ont été transférés sur la
membrane.
La streptavidine est une protéine qui se fixe a
e avec grande affinité à son ligand, la biotine
Le complexe formé par la streptavidine et la biotine possède
e la plus forte
interaction non-covalente connue entre une protéine et son ligand.
La peroxydase de raifort (HRP) est une enzyme qui a
agit sur le substrat utilisé pour la révélation
La peroxydase catalyse
’oxydation du luminol.
En présence d’amplificateurs chimiques et de catalyseurs, lA lumiere est cmt
l’intensité de lumière et sa durée d’émission est
augmentée : c’est la réaction de chemiluminescence augmentée (enhanced chemiluminescence – ECL). L’ECL est une méthode de détection sensible, où la
quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de protéine détectée.
marquag prot specific 4 etape
