cytometri flux Flashcards
deu semaine apre immunisation souris keskel devai produire
Celle-ci devrait donc avoir produit des anticorps IgG spécifiques à l’antigène utilisé pour
l’immunisation.
phase de latence premiere vs deucieme immunistaion
En effet, on se rappelle que suite à l’immunisation primaire, il existe une phase de latence où les lymphocytes B naïfs subissent une sélection clonale et se
différencient ensuite en lymphocytes mémoire ou plasmocyte.
Suite à l’immunisation secondaire, la phase de latence est très courte et est suivie d’une réponse rapide et prolongée, traduite par la sécrétion d’anticorps de
haute affinité pour l’antigène utilisé.
Les différentes classes de cellules immunitaires impliquées dans la réponse humorale sont retrouvées surtout
u niveau des organes lymphoïdes secondaires (rate
et ganglions lymphatiques), ou encore, sont dispersées dans le sang et la lymphe
kel cellule on utilise pr etudier l immunisation de la souris
e. Ainsi, pour étudier les fonctions immunitaires chez la souris, on utilise
habituellement les cellules immunocompétentes de la rarate ou des ganglions
cmt on elimine les erythrocyte de la rate
in d’éliminer les érythrocytes de la rate, on prpr procède à une lyse des globules
rouges avec une solution ACK. L
ACK cki
La solution ACK et une solution d’Ammonium-Chloride-Potassium qui permet d’éliminer les globules rouges sans affecter les globules
blancs. Cette solution peut être utilisée pour traiter la rate, le sang et la moelle osseuse. Pour les ganglions lymphotiques, il n’y a pas de globules rouges
protocole de lyse cellulaire ckoi
-Il faut premièrement obtenir un suspension cellulaire de la rate, centrifuger les cellules et enlever le surnageant.
-Ensuite, il faut ajouter 1 ml de solution ACK sur le culot, bien resuspendre le culot et arrêter la réaction après 1 minutes en ajoutant du PBS ou milieu de culture sur les
cellules.
-On recentrifuge les cellules et resuspend dans du milieu ou du PBS supplémenté avec du sérum pour faire le décompte cellulaire.
-Le sérum permet aux
cellules de mieux survivre.
il est possible de les différencier les lymphocyte grâce
aux glycoprotéines spécifiques qu’ils portent à leur
surface.
cmt on determine les portion des cellule lymphoide de la rate
e. Des anticorps monoclonaux spécifiques à ces glycoprotéines et couplés à des fluorochromes seront utilisés en cytométrie en flux,
permettant ainsi de
déterminer les proportions de chacune des populations de cellules lymphoïdes de la rate.
cytometri flux role
sagit donc d’une technique qui permet de prendre simultanément plusieurs mesures sur des cellules, bactéries ou
autres particules en suspension liquide, de taille variant entre 0.2 et 50 μm.
kel mesure la cytometri pren
(taille, granularité et intensité de fluorescence)
Le cytomètre en flux est composé de trois systèmes leskel
La fluidique;
L’optique;
L’électronique.
mecanisme de la cytometri en flux
L’échantillon en suspension liquide est transporté par le système fluidique à partir du tube d’acquisition jusqu’à la chambre de lecture.
Dans la chambre de lecture,
l’échantillon croise le faisceau laser du système d’optique, en un mince filet qui fait passer les cellules une à la fois.
système d’optique fonctionne en deux temps cmt
1) un complexe formé par le laser, les prismes et les lentilles dirige le faisceau laser vers l’échantillon et excite les
fluorochromes couplés aux anticorps,
2) des lentilles récupèrent la lumière diffusée et la fluorescence, qui sont dirigées vers un système d’amplification du signal
composé de filtres et miroirs, via des câbles de fibre optique.
inalement, les photodétecteurs du système électronique convertissent de manière proportionnelle koi
la lumière détectée par le système d’optique en signaux électroniques, qui sont par la suite digitalisés, analysés et envoyés à l’ordinateur
kel type d info on pe retirer de la cytometri en flux et prk
Les cellules de la suspension arrivent à la queue leu leu devant le faisceau laser. En traversant le faisceau, la cellule diffuse et réfracte la lumière, ce qui nous
renseigne sur sa taille (FSC) et sa granularité (SSC), respectivement
grace a koi on detecte le nb de cellule
Grâce à des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes, il est possible de détecter différentes populations cellulaires selon les glycoprotéines spécifiques
exprimées à leur surface
exemple de anticorp monoclonau
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fluorescence emise est cmt
eut être naturelle (auto-fluorescence) ou, le plus souvent, résulter de l’incorporation de fluorochromes
laser fai koi
e laser excite les fluorochromes, qui
absorbent l’énergie du laser et la réémettent par émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée
photon emis role
Ces photons sont captés par les filtres du système d’amplification du signal,
afin d’être envoyés aux photodétecteurs du système électronique du cytomètre en flux.
Plus il y a de particules de fluorochrome d’excitées , plus..
plus l’intensité de la fluorescence sera élevée
fin de distinguer l’auto-fluorescence de la fluorescence attribuée aux fluorochromes, on,,
s’assure d’avoir un contrôle
de cellules non-marquées, ce qui détermine le bruit de fond, exclusivement attribué à la fluorescence naturelle.
o labo kel fluorochrome on use
Nous utiliserons au laboratoire des anticorps couplés aux fluorochromes FITC (isothiocyanate de fluorescéine) et PE (phycoérythrine).
Ces fluorochromes peuvent
être excités par le laser argon (488 nm) de l’appareil FACSCanto.
