cytometri flux Flashcards
deu semaine apre immunisation souris keskel devai produire
Celle-ci devrait donc avoir produit des anticorps IgG spécifiques à l’antigène utilisé pour
l’immunisation.
phase de latence premiere vs deucieme immunistaion
En effet, on se rappelle que suite à l’immunisation primaire, il existe une phase de latence où les lymphocytes B naïfs subissent une sélection clonale et se
différencient ensuite en lymphocytes mémoire ou plasmocyte.
Suite à l’immunisation secondaire, la phase de latence est très courte et est suivie d’une réponse rapide et prolongée, traduite par la sécrétion d’anticorps de
haute affinité pour l’antigène utilisé.
Les différentes classes de cellules immunitaires impliquées dans la réponse humorale sont retrouvées surtout
u niveau des organes lymphoïdes secondaires (rate
et ganglions lymphatiques), ou encore, sont dispersées dans le sang et la lymphe
kel cellule on utilise pr etudier l immunisation de la souris
e. Ainsi, pour étudier les fonctions immunitaires chez la souris, on utilise
habituellement les cellules immunocompétentes de la rarate ou des ganglions
cmt on elimine les erythrocyte de la rate
in d’éliminer les érythrocytes de la rate, on prpr procède à une lyse des globules
rouges avec une solution ACK. L
ACK cki
La solution ACK et une solution d’Ammonium-Chloride-Potassium qui permet d’éliminer les globules rouges sans affecter les globules
blancs. Cette solution peut être utilisée pour traiter la rate, le sang et la moelle osseuse. Pour les ganglions lymphotiques, il n’y a pas de globules rouges
protocole de lyse cellulaire ckoi
-Il faut premièrement obtenir un suspension cellulaire de la rate, centrifuger les cellules et enlever le surnageant.
-Ensuite, il faut ajouter 1 ml de solution ACK sur le culot, bien resuspendre le culot et arrêter la réaction après 1 minutes en ajoutant du PBS ou milieu de culture sur les
cellules.
-On recentrifuge les cellules et resuspend dans du milieu ou du PBS supplémenté avec du sérum pour faire le décompte cellulaire.
-Le sérum permet aux
cellules de mieux survivre.
il est possible de les différencier les lymphocyte grâce
aux glycoprotéines spécifiques qu’ils portent à leur
surface.
cmt on determine les portion des cellule lymphoide de la rate
e. Des anticorps monoclonaux spécifiques à ces glycoprotéines et couplés à des fluorochromes seront utilisés en cytométrie en flux,
permettant ainsi de
déterminer les proportions de chacune des populations de cellules lymphoïdes de la rate.
cytometri flux role
sagit donc d’une technique qui permet de prendre simultanément plusieurs mesures sur des cellules, bactéries ou
autres particules en suspension liquide, de taille variant entre 0.2 et 50 μm.
kel mesure la cytometri pren
(taille, granularité et intensité de fluorescence)
Le cytomètre en flux est composé de trois systèmes leskel
La fluidique;
L’optique;
L’électronique.
mecanisme de la cytometri en flux
L’échantillon en suspension liquide est transporté par le système fluidique à partir du tube d’acquisition jusqu’à la chambre de lecture.
Dans la chambre de lecture,
l’échantillon croise le faisceau laser du système d’optique, en un mince filet qui fait passer les cellules une à la fois.
système d’optique fonctionne en deux temps cmt
1) un complexe formé par le laser, les prismes et les lentilles dirige le faisceau laser vers l’échantillon et excite les
fluorochromes couplés aux anticorps,
2) des lentilles récupèrent la lumière diffusée et la fluorescence, qui sont dirigées vers un système d’amplification du signal
composé de filtres et miroirs, via des câbles de fibre optique.
inalement, les photodétecteurs du système électronique convertissent de manière proportionnelle koi
la lumière détectée par le système d’optique en signaux électroniques, qui sont par la suite digitalisés, analysés et envoyés à l’ordinateur
kel type d info on pe retirer de la cytometri en flux et prk
Les cellules de la suspension arrivent à la queue leu leu devant le faisceau laser. En traversant le faisceau, la cellule diffuse et réfracte la lumière, ce qui nous
renseigne sur sa taille (FSC) et sa granularité (SSC), respectivement
grace a koi on detecte le nb de cellule
Grâce à des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes, il est possible de détecter différentes populations cellulaires selon les glycoprotéines spécifiques
exprimées à leur surface
exemple de anticorp monoclonau
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fluorescence emise est cmt
eut être naturelle (auto-fluorescence) ou, le plus souvent, résulter de l’incorporation de fluorochromes
laser fai koi
e laser excite les fluorochromes, qui
absorbent l’énergie du laser et la réémettent par émission de photons d’une longueur d’onde plus élevée
photon emis role
Ces photons sont captés par les filtres du système d’amplification du signal,
afin d’être envoyés aux photodétecteurs du système électronique du cytomètre en flux.
Plus il y a de particules de fluorochrome d’excitées , plus..
plus l’intensité de la fluorescence sera élevée
fin de distinguer l’auto-fluorescence de la fluorescence attribuée aux fluorochromes, on,,
s’assure d’avoir un contrôle
de cellules non-marquées, ce qui détermine le bruit de fond, exclusivement attribué à la fluorescence naturelle.
o labo kel fluorochrome on use
Nous utiliserons au laboratoire des anticorps couplés aux fluorochromes FITC (isothiocyanate de fluorescéine) et PE (phycoérythrine).
Ces fluorochromes peuvent
être excités par le laser argon (488 nm) de l’appareil FACSCanto.
o. Une fois excités par le faisceau laser, ces fluorochromes utilisé emmete koi
vont émettre un spectre de fluorescence à
520 nm et 576 nm, respectivement. I
il sera ainsi possible, à l’aide des filtres appropriés (filtres 530/30 et 585/42, respectivement), de déterminer la proportion de
chacune des populations lymphocytaires
ckoi un deversemen de fluorescence
On remarque qu’une partie du spectre d’émission du fluorochrome FITC est captée par le filtre 585/42, qui est utilisé pour détecter le fluorochrome PE. C’est ce
qu’on appelle du déversement de fluorescence.
cause du deversemen de fluorescence
Le déversement de fluorescence est causé par le chevauchement physique des spectres d’émission de certains fluorochromes.
kan se produi deversemen de fluorescnce
Le déversement de fluorescence se produit lorsque l’émission de fluorescence d’un fluorochrome est détectée par un détecteur désigné pour mesurer le
signal provenant d’un autre fluorochrome
La quantité de déversement de fluorescence est une fonction
n linéaire, ce qui permet la correction des niveaux de signaux moyens mesurés par un procédé
appelé la compensation.
ckoi compensation, cmt on fai
En effectuant une série de marquage simple (un seul fluorochrome), on peut mesurer le déversement de chacun des fluorochromes utilisés dans chacun des filtres
du cytomètre en flux. On soustrait ensuite ces déversements aux mesures prises lors de l’acquisition des échantillons : c’est ce qu’on appelle la compensation. Si les
contrôles de compensation ne sont pas effectués, la juste interprétation des résultats est impossibl
Les premiers modèles de cytomètre en flux, développés dans kel anne
es années 1970, ne possédaient qu’un seul laser et permettaient une analyse limitée à quelques fluorochromes.
cytometri de mnt permette koi
cytomètres en flux peuvent aujourd’hui être équipés de six lasers avec différentes longueurs d’onde d’excitation, permettant de détecter jusqu’à 32 paramètres. Imaginez le cassetête d’interprétation si les contrôles de compensation ne sont pas correctement effec
cmt on presente les rsultat, ckoi le nuage de pt
On débute habituellement par un nuage de points (dot plot) FSC vs SSC, où chaque point correspond à une cellule distincte, représentée selon sa taille et sa
granularité
En ajoutant une fenêtre autour d’un groupe de cellules (événements), on peut
concentrer l’analyse subséquente sur les cellules contenues dans celle-c
cki les facteurs peuvent avoir un impact sur l’exactitude et la qualité des résultats
-Le facteur le plus critique est la détermination du fluorochrome qui devrait être
conjugué à chaque anticorps utilisé dans le panel, en raison du large éventail d’intensités de brillance, et de brillance intrinsèque parmi les fluorochromes
commercialisés.
En effet, certains antigènes sont exprimés faiblement alors que d’autres sont exprimés fortement, ce qui peut causer de l’interférence optique entre
les signaux générés par les différents fluorochromes.
-plutôt d’ordre mécanique
ue certains marqueurs à l’étude peuvent être coexprimés par une cellule unique. ??
oui
kan ya coexprimation de marquur par une mem cellule keski spasse
lorsque c’est le cas, la présence simultanée de
différents fluorochrome peut contribuer de façon significative au bruit de fond optique, et ce, selon la proportion de leurs brillances respectives
facteu d ordre mecanique a prendre en consideration c leskel
Le FACSCanto (le modèle de cytomètre en flux utilisé) a la capacité de faire l’acquisition des évènements dans un intervalle de vitesse allant de 10 µL/min à 120 µL/min.
En règle générale, on doit acquérir un minimum de 10 cellules totales (i.e. pas seulement les cellules
qui seront marquées positivement) afin de pouvoir procéder à l’analyse des résultats.
On suggère alors d’avoir des échantillons de concentration cellulaire se situant
entre 10 et 2x10 cellules/mL pour l’utilisation de cet appareil.
pr cytometri c la vitesse max ki est utilisé?
Alors qu’il serait tentant de toujours utiliser la vitesse maximale afin de sauver du temps, on doit garder en tête que l’accroissement de la vitesse d’acquisition signifie
un élargissement du flux d’échantillon.
Ainsi, certaines cellules sont décentralisées dans le flux et le fluorochrome conjugué à l’anticorps qui y est lié reçoit ainsi une
excitation sous-optimale du laser, ce qui se traduit par une perte de résolution au niveau du résultat
