I.2. Microscopie et préparation des échantillons Flashcards
réfraction d’un rayon lumineux
dévié à l’interface entre les deux milieux par arpport à sa direction d’incidence
quand passe d’un milieu à l’autre
indice de réfraction
mesure combien un milieu ralentit la vitesse de la lumière
la direction et l’angle de déviation sont déterminés par
les indices de réfraction des deux milieux formant l’interface
lentille convexe
focalise des rayons lumineux en un point spécifique, le foyer
distance focale
distance entre le centre de la lentille et le foyer
la puissance d’une lentille dépend de
la distance focale
plus la distance focale est courte, plus on agrandit un objet
5 types de microscopes optiques
à fond clair à fond noir à contraste de phase confocal à fluorescence
microscope composés
image agrandie est formée par 2 lentilles ou plus
microscope à fond clair
utilise la lumière
permet d’observer des objets ou des être vivants entre 1µm et 1mm
miroirs pour dévier les rayons lumineux dans la trajectoire choisie
image foncée sur fond brillant
résolution d’un microscope
capacité d’une lentille à séparer ou distinguer des petits objets qui sont près l’un de l’autre, donc à rendre l’image plus nette
formule résolution d’un microscope
d=0.5gamma / n sin teta
ouverture angulaire
teta
moitié de l’angle du cône de lumière qui vient de l’échantillon et pénètre dans la lentille
ouverture numérique
n sin teta
objectif à immersion
huile à immersion à un indice de réfraction similaire au verre, donc augmente la résolution car on substitue l’air pour l’huile
distance de travail
distance entre la surface antérieure de la lentille et la surface de la lame couvre-objet/l’échantillon après la mise en point
microscope à fond noir
autour de l’échantillon apparait noir, tandis que l’objet est brillant
utilisé pour observer des organismes vivants non colorés ou peu contrastés
microscope à contraste de phase
transforme de légères différences d’indice de réfraction et de densité cellulaire en différences d’intensité lumineuses observables
bon pour cellules vivantes
microscope confocal
rayon laser focalisé touche un point de l’échantillon
ordinateur compile les images générées pour reconstruire une image 3D
microscope à fluorescence
éclaire l’échantillon avec une lumière UV, violette ou bleue
échantillons contrastés par un colorant appelé fluorochrome
image de l’objet résultante de la lumière fluorescente émise par le spécimen
buts de la préparation des échantillons
augmenter la visibilité
accentuer les particularités morphologiques spécifiques
préserver les échantillons en vue d’études ultérieures
fixés et colorés
fixation d’un échantillon
procédé par lequel les structures internes et externes des cellules et des organismes sont conservées et fixées en place
2 types de fixation
à la chaleur
chimique
fixation à la chaleur
conserve la morphologie générale mais pas les structures intracellulaires
fixation chimique
protège les structures cellulaires fines et la morphologie des microorganismes plus grands et plus délicats
coloration
rend les structures internes et externes de la cellule plus visibles en augmentant le contraste avec l’arrière-plan
deux propriétés en communes à tous les colorants
possèdent des groupes chromophores
peuvent se lier au cellules par interactions ionique, covalente ou hydrophobe
groupes chromophores
doubles liaisons conjuguées, donnent la couleur au colorant
coloration simple
un seul colorant est utilisé
basique ou acide
colorant basiques
possèdent des charges positives qui se fixent à des molécules chargées négativement
crystal violet, bleu de méthylène, safranine
colorants acides
possèdent des charges négatives qui se fixent à des molécules chargées positivement
éosine, rose bengale
coloration différentielle
distingue les microorganismes sur la base de leur coloration
Gram, acido-alcoolo-résistante
coloration gram
méthode de coloration la plus largement utilisée en bactériologie
divise les bactéries en gram + (violet) et gram - (rouge)
4 étapes coloration gram
fixation
coloration primaire (violet de cristal)
lavage et décoloration
contre coloration (safranine)
coloration alcoolo-résistante
particulièrement utile pour identifier des espèces acido-alcoolo-résistantes de genre Mycobactérium
rouge = acido-alcoolo-résistante
bleu = non acido-alcoolo-résistante
3 étapes de coloration alcoolo-résistante
chauffage avec mélange de fushine basique et phénol
décoloration avec un mélange alcool-acide
contre coloration avec bleu de méthylène
coloration négative
on utilise souvent de l’encre de chine ou de la nigrosine pour révéler les capsules qui entourent certaines bactéries
coloration des endospores
coloration de Shaeffer-Fulton
endospores apparaissent vertes/bleu dans une cellule rouge/rose
coloration des flagelles
un mordant est utilisé afin d’épaissir les flagelles avant de les colorer
microscopie électronique
un faisceau d’électrons est utilisé pour produire une image
la longueur d’onde d’un faisceau d’électron est plus courte que celle de la lumière, résultant en une meilleure résolution
différents outils de microscopie électronique
microscope électronique à transmission (TEM)
microscope électronique à balayage
cryotomographie électronique
microscope à balayage de sondes
microscopie électronique à transmission
électrons sont diffractés lorsqu’ils traversent l’échantillon
faisceau d’électrons focalisé par lentilles magnétiques pour former une image visible agrandie de l’échantillon sur un écran fluorescent
doit être sous vide
échantillons très fins
ombrage métallique
TEM
échantillon enduit d’une fine couche de métaux lourds
cryodécapage
TEM
échantillons congelés sont fracturés le long des lignes de plus grande fragilité
microscopie électronique à balayage
produit une image à partir des électrons réfractés par la surface de l’objet plutôt qu’à partir des électrons transmis
produit une image 3D de la surface du micro-organisme avec une grande profondeur de champ
photomultiplicateur
dans électronique à balayage
amplifie la lumière des électrons secondaire et donne l’effet de profondeur
cryotomographie électronique
échantillons plongés dans un liquide très froid et observés alors qu’ils sont encore congelés
préserve l’état natif des structures cellulaires
2 types de microscopie à balayage de sonde
à effet tunnel
à force atomique
microscope à effet tunnel
détermine les caractères de surface en balayant la surface de l’objet avec une sonde ponctuelle
grossissements de 100 milions
atomes
microscope à force atomique
déplace une sonde effilée à la surface de l’échantillon tout en maintenant constant la distance entre la pointe de la sonde et cette surface
étude de surfaces qui ne conduisent pas bien l’électricité
