HPLC Flashcards
Describa el fundamento de la HPLC
Proceso basado en la interaccion diferencial de los analitos de la muestra con dos fases en contacto, fase móvil y fase estacionaria, donde la FM se encarga de llevar a la muestra por la superficie de la FE.
En este caso la FE se encuentra fija a un material finamente pulverizado, lo cual aumenta la superficie expuesta generando un aumento en la eficiencia y por ende, resolución. Debido a que hay un mayor número de equilibrios generando la separación diferencial de los componentes.
Se requiere de hacer presión para que el solvente fluya, a través del uso de un sistema de bombeo, que asegura que la FM llegue a la columna. Lo que a su vez, hace que el sistema sea reproducible.
Mencione los componentes del equipo
- Recipiente con la FM
- Sistema de bombeo de FM
- Sistema de inyección de la muestra
- Columna cromatográfica en un horno
- Detector
https://cientisol.com/wp-content/uploads/2023/04/Set-up-of-a-reverse-phase-HPLC-system-showing-the-pump-injection-port-column-detector.png
Mencione los sistema de bombeo de FM que conoce para HPLC y describa uno de ellos
Apunta a describir el de bombas recíprocas
Se puede trabajar a flujo constante o a presión constante
Flujo constante: encontramos las bombas recíprocas que poseen un piston que cuando no se encuentra haciendo presión permite el ingreso de solvente a través de una válvula, mientras que otra válvula que va hacia la columna se haya cerrada. Al ejercer presión la posición de las válvulas cambia y la FM ingresa a la columna generando así pulsos de FM.
¿Qué es loop en HPLC y por qué es importante?
El loop se encuentra en el sistema de inyección de la muestra, el cual conecta con las válvulas de FM para que esta empuje la muestra hacia la columna.
Cuando el sistema se encuentra “cargando” la muestra, el loop no esta concetado, pero en posición de “inyección” las válvulas conectan con el loop y así va la muestra hacia la columna.
El loop carga un volumen de muestra conocido e intercambiable, es decir, los volumenes son reproducibles y si se cambia el loop puede variarse la cantidad de muestra que se introduce en la columna, es es importante porque otorga reproducibilidad al sistema, lo que a su vez permite la cuantificación con un estándar externo.
Mencione los detectores universales de HPLC
- Detector del índice de refracción
- Deterctor conductimétrico
¿Cómo se clasifican los detectores en HPLC?
- Universales: miden propiedades fisicoquímicas de FM pura y con el analito
- Específicos: miden una propiedad del analito característica.
Mencione los detectores específicos de HPLC
Qué mide cada uno de ellos
- Detector de UV-Visible: mide la energía transmitida cuando la muestra pasa por el mismo, eligiendo una longitud de onda de trabajo que no absorba la FM
- Detector de arreglo de diodos (DAD)= mide un rango de longitudes de onda simultaneamente, aportando info. de pureza del pico
- Detector de fluorescencia: mide la emisión de luz radiante de la muestra, util para muestras que fluorescen.
- Detector electroquímico: util para analitos con propiedades redox
- Detector de espectrometría de masa: otorga información estructural
Cuales son las características de un detector ideal en HPLC
- Sensibilidad y reproducibilidad
- Precisión
- Exactitud
- Linealidad
- Accesibilidad
- Tiempo de respuesta corto
- No destructivo
- Volumen interno mínimo
¿Cuál es la diferencia entre la fase normal y fase reversa?
- NORMAL (hidrofílico) : FE mayor polaridad; FM menor polaridad.
Sílica, alúmina o fases enlazadas. - REVERSA (hidrofóbico) : FE menor polaridad; FM mayor polaridad.
C18, C8, fenil, ciano o amino.
Factores a tener en cuenta para la elección de la FM en HPLC
- Polaridad del soluto y FM
- Posibilidad de formar puentes de hidrógeno
- Grupos funcionales del soluto
Mencione las formas de elución en HPLC
- Isocrática: un sola composición de FM
- Elución con gradiente: se realiza un gradiente modificando solventes de FM, aumentando la fuerza de elución.
