Histologische technieken Flashcards
Histologische technieken
Wat is het doel van histologische technieken?
Weefsels en organen observeerbaar maken voor LM of EM
Wat zijn de bewerkingsstappen van weefsels?
- fixeren
- inbedden
- snijden
- kleuren of contrasteren
STAP 1: FIXEREN: wat is het doel
- bewaren van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur (EWdenaturatie)
- permeabiliseren van celmembraan
- harder en poreuzer maken van weefsel
STAP 1: FIXEREN: methoden
- chemische fixatie (perfusie of immersie)
- koude fictie (invriezen)
STAP 2: INBEDDEN: doel
Doel: gefixeerd materiaal ontwikkelen en doordringen met inbedmiddel
STAP 2: INBEDDEN: kenmerken inbedmiddel
Kenmerken:
1. substantie die in vloeibare vorm in weefsel indringt
2. substantie die na indringing hard wordt
3. materiaal snijdbaar in coupes
Voorbeelden: paraffine, harsen, plastics
STAP 2: INBEDDEN: probleem
Inbedmiddelen hydrofoob, weefsel veel water
-> weefsel eerst ontwateren in alcoholbaden
-> clearing in tolueen
STAP 3: SNIJDEN
Doel: snijden van weefselblokje in zo dun mogelijke coupes
paraffine: microtoom met stalen mes
-> doorlaatbaar voor licht, geschikt voor LM
harsen, plastics: microtoom met glazen mes of diamantmes
STAP 4: KLEUREN (LM)
Welke kleuringen zijn er? + doel
- Haematoxyline-eosinekleuring (HE): doel: aankleuren van zure en basische bestanddelen
- PAS-kleuring (period acid Schiff): doel: aantonen van polysacchariden
- Feulgen-kleuring: doel: aantonen van DNA
- Enzymhistochemie: doel: visualiseren van enzymale activiteit
- Autoradiografie: doel: visualiseren van metabole activiteit
- Immunohistochemie (IH): doel: visualiseren van specifieke moleculen via antigen-antilichaambinding
- In situ hybridisatie (ISH): doel: visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA en RNA
Leg uit HE kleuring
- pH heel bepalend (belang iso-elektrisch punt (IEP))
- haematoxyline (kationische, basische kleurstof) kleurt zure bestanddelen blauw (=basofiel)
- eosine (anionische, zure kleurstof) kleurt basische bestanddelen roos (=eosinofiel)
- kleurstoffen bestaan uit chromofoor (= eigenlijke kleurdrager) en autochroom (maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan weefsel)
- niet beste keuze bij koolhydraten/sacchariden en lipiden/vetten
leg uit metachromasie
weefselstructuren kleuren rood/paars ipv blauw
-> door vorming dimeren tussen kleurstofmoleculen
in weefsels met hoge densiteit aan zure groepen
waarom HE-kleuring niet best bij visualiseren koolhydraten/sacchariden?
- vaak gebonden aan andere soorten moleculen
- meestal slecht kleurbaar met HE
- metachromatisch kleuren
waarom HE-kleuring niet best bij visualiseren van lipiden/vetten?
- vetten lossen op in alcohol => je verliest ze tijdens weefselbewerking
- neutrale vetten kleuren met vetoplosbare kleurstoffen
- gebruik OsO4 bij EM: bindt aan vetzuurketens => visualiseerbaar
PAS-kleuring
= period acid-schiff
aantonen van polysacchariden
Principe: glycolgroepen => aldehydegroepen door oxidatie door perjoodzuur
aldehydegroepen reageren met kleurloos Schiff-reagens
=> paarsrode kleur
Feulgen-kleuring
aantonen van DNA
Principe: hydrolyse van DNA door zoutzuur => purinebasen komen vrij van desoxyribose
=> ontstaan aldehydegroepen op desoxyribose
aldehydegroepen reageren met Schiff-reagens
=> paarsrode kleur
Enzymhistochemie
Visualiseren van enzymale activiteit
Toevoegen van specifiek substraat
Vorming van waarneembare neerslag (weinig lichtdoorlaatbaar)
Autoradiografie
Visualiseren van metabole activiteit
Toevoegen van radioactief gemerkte precursor
Coupes in contact brengen met fotografische emulsie
Immunohistochemie (IH)
visualiseren van specifieke moleculen via antigen-antilichaam-bidning
adv antilichaam voorzien van een merker voor LM, FM, EM
Vaak fluorescerende merkers (fluorochromen)
In situ hybridisatie (ISH)
Visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorde in DNA en RNA
adhv DNA/RNA-probes voorzien van een merker
Vaak fluorescerende merkers (fluorochromen)
STAP 4: CONTRASTEREN (EM)
Doel: visualisatie van cellen, celbestanddelen en extracellulair materiaal in weefsel, anders kleurcontrast in coupes laag
Via magneetspoelen weefsel bestralen met elektronenbundel
Elektronenbundel?
Versnelde elektronen met één golflengte (veel korter dan zichtbaar licht, geen kleuren)
Elektronenverstrooiing door weefsel
elektronen doorgelaten => zwarting op negatief
elektronen niet doorgelaten => zwarting op positief
Probleem: weefsel toont weinig densiteitsverschillen
=> verhogen = contrasteren
toevoegen van zware metalen => toename contrast
Lichtmicroscopie
lichtbron = zichtbaar licht
beeldvorming door glazen lenzen, op het oog
contrasteren via kleurstoffen
vergroting: oculair maal objectief
scheidend vermogen/resolutievermogen (RV)
Soorten lichtmicroscopie
- Helderveld
- Fasecontrast
- Interferentiecontrast
- Fluorescentiemicroscopie
- Confocal microscopie
Scheidend vermogen/resolutievermogen (RV)
= afstand tussen 2 dicht naast elkaar gelegen punten die door het toestel worden onderscheiden
RV = 0,61*golflengte/NA
golflengte = 550 nm
Elektronenmicroscopie (EM)
Elektronenbundel met korte golflengte
Beeldvorming door magneetspoelen, indirect via fluorescerend scherm, fotografische plaat of digitale camera
Contrasteren met zware metalen
vergroting tot > 100 000x
Soorten EM
TEM (transmission EM)
SEM (scanning EM)
RV EM
= 0,61*golflente/NA
golflengte = 1,22/sqrt(hoogspanning)
Virtuele microscopie
Microscopische preparaten automatisch ingescand in totaliteit op grote vergroting (40x)
beelden bekijken op computer
je kan
- navigeren
- inzoomen/uitzoomen
