Histologische technieken Flashcards
Histologische technieken
Wat is het doel van histologische technieken?
Weefsels en organen observeerbaar maken voor LM of EM
Wat zijn de bewerkingsstappen van weefsels?
- fixeren
- inbedden
- snijden
- kleuren of contrasteren
STAP 1: FIXEREN: wat is het doel
- bewaren van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur (EWdenaturatie)
- permeabiliseren van celmembraan
- harder en poreuzer maken van weefsel
STAP 1: FIXEREN: methoden
- chemische fixatie (perfusie of immersie)
- koude fictie (invriezen)
STAP 2: INBEDDEN: doel
Doel: gefixeerd materiaal ontwikkelen en doordringen met inbedmiddel
STAP 2: INBEDDEN: kenmerken inbedmiddel
Kenmerken:
1. substantie die in vloeibare vorm in weefsel indringt
2. substantie die na indringing hard wordt
3. materiaal snijdbaar in coupes
Voorbeelden: paraffine, harsen, plastics
STAP 2: INBEDDEN: probleem
Inbedmiddelen hydrofoob, weefsel veel water
-> weefsel eerst ontwateren in alcoholbaden
-> clearing in tolueen
STAP 3: SNIJDEN
Doel: snijden van weefselblokje in zo dun mogelijke coupes
paraffine: microtoom met stalen mes
-> doorlaatbaar voor licht, geschikt voor LM
harsen, plastics: microtoom met glazen mes of diamantmes
STAP 4: KLEUREN (LM)
Welke kleuringen zijn er? + doel
- Haematoxyline-eosinekleuring (HE): doel: aankleuren van zure en basische bestanddelen
- PAS-kleuring (period acid Schiff): doel: aantonen van polysacchariden
- Feulgen-kleuring: doel: aantonen van DNA
- Enzymhistochemie: doel: visualiseren van enzymale activiteit
- Autoradiografie: doel: visualiseren van metabole activiteit
- Immunohistochemie (IH): doel: visualiseren van specifieke moleculen via antigen-antilichaambinding
- In situ hybridisatie (ISH): doel: visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA en RNA
Leg uit HE kleuring
- pH heel bepalend (belang iso-elektrisch punt (IEP))
- haematoxyline (kationische, basische kleurstof) kleurt zure bestanddelen blauw (=basofiel)
- eosine (anionische, zure kleurstof) kleurt basische bestanddelen roos (=eosinofiel)
- kleurstoffen bestaan uit chromofoor (= eigenlijke kleurdrager) en autochroom (maakt kleurstof wateroplosbaar en bindt chromofoor aan weefsel)
- niet beste keuze bij koolhydraten/sacchariden en lipiden/vetten
leg uit metachromasie
weefselstructuren kleuren rood/paars ipv blauw
-> door vorming dimeren tussen kleurstofmoleculen
in weefsels met hoge densiteit aan zure groepen
waarom HE-kleuring niet best bij visualiseren koolhydraten/sacchariden?
- vaak gebonden aan andere soorten moleculen
- meestal slecht kleurbaar met HE
- metachromatisch kleuren
waarom HE-kleuring niet best bij visualiseren van lipiden/vetten?
- vetten lossen op in alcohol => je verliest ze tijdens weefselbewerking
- neutrale vetten kleuren met vetoplosbare kleurstoffen
- gebruik OsO4 bij EM: bindt aan vetzuurketens => visualiseerbaar
PAS-kleuring
= period acid-schiff
aantonen van polysacchariden
Principe: glycolgroepen => aldehydegroepen door oxidatie door perjoodzuur
aldehydegroepen reageren met kleurloos Schiff-reagens
=> paarsrode kleur
Feulgen-kleuring
aantonen van DNA
Principe: hydrolyse van DNA door zoutzuur => purinebasen komen vrij van desoxyribose
=> ontstaan aldehydegroepen op desoxyribose
aldehydegroepen reageren met Schiff-reagens
=> paarsrode kleur
