Gentechnik Flashcards
Was ist eine PCR? Wozu wird sie genutzt?
Die Polymerasekettenreaktion (PCR für polymerase chain reaction) dient der Vervielfältigung von DNA-Abschnitten, z.B. für Vaterschaftstest, genetische Fingerabdrücke oder Erkennung von Krankheitsgenen.
Bei jedem Zyklus wird die DNA-Menge verdoppelt, es kommt daher zu einer exponentiellen Vermehrung.
Die Einzelstränge werden aufgetrennt und an jedem Einzelstrang bildet die DNA-Polymerase einen komplementären Strang. Danach liegt also die doppelte Anzahl von DNA-Strängen vor. Wird der Schritt wiederholt, dann verdoppelt sich auch hier wieder die Anzahl der Stränge.
In der Praxis wird dieser Zyklus 20-50x wiederholt.
PCR: wie groß ist die DNA-Menge nach 10 Zyklen? Wie groß nach 20 und 30 Zyklen?
Bei 10 Zyklen wird die DNA-Menge vertausendfacht (10 Verdopplungen, 2^10 sind ca. 1000).
Nach 20 Zyklen ist daher die millionenfache Menge vorhanden (1000 * 1000 = 1.000.000). Nach 30 die tausendfache Menge einer Million, was eine Milliarde ist.
Wie lauten die einzelnen Schritte der PCR?
Denaturierung, Primerhybridisierung (“Annealing”) und Elongation.
PCR: was geschieht bei der Denaturierung?
Damit der Doppelstrang sich in zwei Einzelstränge teilt, müssen die Wasserstoffbrückenbindungen aufgetrennt werden. Da es keine kovalente Bindungen sind, reicht hier Hitze, um die Molekularbewegung so zu erhöhen, dass die Wasserstoffbrücken gelöst werden.
Für die Denaturierung wird die doppelstränge DNA daher auf ca. 95° C erhitzt
PCR: was geschieht bei der Primerhybridisierung (“Annealing”)?
Da die DNA-Polymerase nicht „frei“ mit der Synthese eines neuen Strangs beginnen kann, sondern wie bei der DNA-Replikation einer Zelle immer einen Primer benötigt, müssen in der Lösung Primer vorhanden sein, die sich an die DNA anlagern. Hierfür wird die Temperatur abgesenkt.
Die Primer bestehen hier aber nicht aus RNA, sondern aus DNA, verbleiben daher einfach im neu gebildeten Strang und müssen nicht entfernt werden.
Die Primer müssen genau zu der DNA passen, die vervielfältigt werden soll. Also komplementär zum Anfang eines Strangs sein, ab dem dann die DNA-Polymerase vervollständigen kann.
Man benötigt daher zwei verschiedene Primer für beide Einzelstränge, weil ein Primer immer nur komplementär zu einem Strang sein kann.
Meist möchte man nicht den kompletten DNA-Strang vervielfältigen, sondern nur einen Abschnitt, die Primer müssen dann jeweils komplementär zum Beginn dieses Abschnitts sein.
PCR: was geschieht bei der Elongation? Was ist die Taq-Polymerase und warum ist sie notwendig?
Hier findet die Vervollständigung des Strangs statt. Die DNA-Polymerase beginnt am Primer und bildet bis zum Ende der DNA einen komplementären Strang.
Auch hier wird der neue Strang von 5‘ zum 3‘-Ende gebildet. Dafür benötigt die DNA-Polymerase die Nukleotide, die in der Lösung in Form von Nukleotidtriphosphaten schwimmen müssen. Also Desoxyadenosintriphosphat (dATP), dCTP, dGTP und dTTP.
Die Energie, die beim Abspalten von zwei Phosphaten frei wird, wird für die Polymerisation genutzt. Außerdem benötigt die Polymerase Mg2+ zum Arbeiten.
Damit die Polymerase nicht schon bei der Denaturierung zerstört wird, verwendet man in der Regel hitzestabile DNA-Polymerase eines Bakteriums, das in heißen Quellen vorkommt (Termus aquaticus). Die Polymerase wird Taq-Polymerase genannt. Sie arbeitet am besten bei Temperaturen von ca. 70°C.
Fasse zusammen, was genau für die PCR benötigt wird.
(1) Eine zu vervielfältigende DNA
(2) Zwei passende Primer. Von den beiden dann jeweils sehr viele, da sie Teil der neuen DNA-Stränge werden, bei der PCR also „verbraucht“ werden
(3) Die DNA-Polymerase mit Mg2+
(4) Die 4 Nukleotide in Form von dATP, dGTP, dCTP und dTTP
(5) Der „Thermocycler“ in dem die Reaktion stattfindet, der die Temperatur entsprechend der Schritte zyklisch herauf und herunterregelt.
PCR: wie viele Durchgänge braucht es bis ein PCR-Produkt der exakt gewünschten Länge entsteht?
Es braucht zwei Durchgänge (Altfrage!). Nach dem ersten Durchgang liegen die Produkte noch zu lang vor (korrekter Anfang, aber in die andere Richtung über das Ziel hinaus.
Also erst nach dem zweiten Durchlauf gibt es genau den gewünschten DNA-Abschnitt zumindest als Einzelstrang. Damit ein Doppelstrang in der gewünschten Länge vorliegt, benötigt es einen weiteren Zyklus.
Erläutere den Begriff “Klonierung”.
Beim Klonieren geht es um die Herstellung und Vervielfältigung identischer DNA.
Die PCR erlaubt die Vervielfältigung von DNA im Labor (in vitro = im Reagenzglas), Klonierung erlaubt die Vervielfältigung in vivo (im Lebewesen).
Dies macht man sich z.B. zunutze, um Gene in Bakterien einzufügen, mit dem Ziel, dass diese Bakterien dann das Protein produzieren. Dabei wird die gewünschte DNA in das ringförmige Plasmid von Bakterien eingeschleust.
Was wird für die Klonierung benötigt?
(1) Das Gen, das man einschleusen will
(2) Das Plasmid
(3) Ein Enzym, das das Plasmid öffnet (Restriktionsendonuklease), damit die DNA eingefügt werden kann
(4) Ligase, um die Stücke wieder zu verbinden
Was sind Nukleasen? Wie lassen sich diese unterteilen? Was zeichnet Restriktionsendonukleasen aus?
Nukleasen sind Enzyme, die DNA abbauen, indem sie die Bindungen zwischen den Nukleotiden spalten.
Man unterscheidet Exonukleasen, die Nukleotide immer nur von den Enden abspalten und Endonukleasen, die innerhalb der DNA die Bindungen trennen.
Restriktionsendonukleasen sind Endonukleasen, die die DNA nur an bestimmten Stellen spalten, also nur bei einer bestimmten Basensequenz.
Die Restriktionsendonukleasen schneiden so, dass „Überhänge“ an der DNA entstehen. Wenn die einzufügende DNA und das Plasmid genau mit der gleichen Restriktionsendonuklease geschnitten wurden, sind die überhängenden Enden („sticky ends“ ) von Insert und Plasmid komplementär zueinander, da sie an Stellen mit gleicher Basensequenz geschnitten werden. So lässt sich das Insert gut ins Plasmid einfügen.
Welche Rolle spielt Ligase bei der Klonierung?
Nach der Restriktion bildet Ligase die Esterbindungen, damit Insert und Plasmid sich kovalent binden und zu einem ringförmigen DNA-Molekül werden.
Welche unerwünschten Ergebnisse können bei der Klonierung auftreten? Welche Möglichkeit gibt es, dieses Problem zu lösen?
Das Einfügen funktioniert nicht immer, da sich die DNA zufällig genau in die Lücke des Plasmids einfügen muss.
Die Ligase kann auch nur das Plasmid ohne eingefügtes Insert wieder schließen, oder auch nur das Insert zu einem Ring verbinden.
Meist wird versucht, die Bakterien mit dem gewünschten Plasmid zu selektieren, z.B. indem in der einzufügenden DNA zusätzlich ein Gen für Antibiotikaresistenz eingefügt wird. Bei Behandlung mit diesem Antibiotikum überleben nur die Bakterien, die ein Plasmid mit dem gewünschten DNA-Abschnitt haben.
Alternativ kann das Insert auch für ein Protein kodieren, welches zu einer Farbreaktion führt, wodurch optisch sichtbar wird, welche Bakterienkolonien das Insert in ihren Plasmiden tragen.
Welches essentielle Medikament kann durch Klonierung hergestellt werden? Was bezeichnet hier der Begriff rekombinante Proteinexpression?
Menschliches Insulin (ein Polypeptid) kann so durch Bakterien hergestellt werden.
Da der genetische Code universell ist, also in allen Lebewesen gleich, wird durch die eingefügte menschliche DNA vom Bakterium auch das gleiche Polypeptid hergestellt. Dies bezeichnet man auch als „rekombinante Proteinexpression“. „Rekombinant“ steht dafür, dass die DNA mithilfe von Gentechnik neu zusammengesetzt (kombiniert) wurde.
Welcher Aspekt der menschlichen DNA stellt ein Problem bei der Klonierung dar? Wie kann dieses Problem gelöst werden? Was ist in diesem Zusammenhang cDNA?
Die DNA darf keine Introns enthalten, da Bakterien nicht Spleißen. Wenn in der menschlichen DNA Introns enthalten sind, und erst nach Spleißen die korrekte mRNA gebildet wird, aus der das korrekte Polypeptid hergestellt wird, würde beim Bakterium aus der eingefügten menschlichen DNA ein anders Polypeptid herauskommen, da das Bakterium bei der Transkription die Introns aus der mRNA nicht herausschneidet.
Dieses Problem kann man umgehen, indem man statt der menschlichen bzw. eukaryontischen DNA die fertige mRNA nach Spleißen nimmt, und sie mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase wieder in DNA umschreibt, welche dann komplementär zur fertigen mRNA ist und damit keine Introns mehr enthält. Diese DNA kann dann ins Bakterienplasmid eingefügt werden.
Die durch das Enzym gebildete DNA wird dann als cDNA bezeichnet, was für komplementäre (complimentary) DNA steht. Wird die cDNA ins Bakterienplasmid eingefügt, kann nun wirklich das gewünschte Protein entstehen, auch ohne Spleißen.
