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Fachkurs bakterielle Genetik > Genetische Methoden > Flashcards

Genetische Methoden Flashcards

1
Q

Was ist eine Transformation?

A

DNA wird vom Spender fregesetzt und von Empfänger aufgenommen

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2
Q

Was ist das Griffith Experiment?

A

Stepptococcus pneumonia: können mit Schleimkapseln (smooth) Körper infizieren, R-Mutanten isoliert: ohne Hülle (rough) nicht mgl.

  • dr. Hitze abgetötete S-Zellen + R-Zellen in Mäuse injiziert
  • aus toter Maus isoliert: lebene S-Zellen
  • aus toten S-Zellen DNA zur Kapselbildung freigesetzt und in R-Zellen aufgenommen –> Transformation zu S-Zellen
  • Elektroporation fördert Transformation
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3
Q

Was ist Transduktion?

A

Übertragen v. DNA mit Bakteriophagen

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4
Q

Erkläre die allgemeine Transduktion?

A
  • lyt. Zyklus
  • beliebige Region des Wirts-Genoms wird übertragen
  • Wirts-DNA wird anstelle des Virusgenoms in Phagenkopf gepackt
  • Enzyme, die für das Verpacken viraler DNA verantwortl. sind, packen manchmal Wirt-DNA in Kopf –> Virionen (transduzierende Partikel) entstehen: führen nicht zur Virusinfektion, sind defekt
  • Lyse –> defekte Phagen werden m. normalen Phagen freigesetzt –> Lysat erhält Mix aus beidem –> die meisten Zellen werden m. normalen Phagen infiziert
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5
Q

Was ist Konjugation?

A

Plasmid -od Chromosomenübertragung

  • genet. Transfer dr. Zell-zuZell-Kontakt
  • v. Plasmiden genutzt, um Kopien von sich selbst auf Wirt zu transferieren
  • F-Plasmid: hat Region m. Genen zur Regulation der DNA-Replikation, hat transponierbare Elemente, durch die Plasmid in Wirtschromosom eindringen kann (Transferfkt.)
  • Plasmid-DNA wird gebrochen u. zu Empfänger (F-) transportiert –> in Empfänger Synthese des Komplementärstranges –> beide haben vollständige Plasmdie nach Rekombi
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6
Q

Was ist homologe Rekombi?

A
  • homologe DNA-Moleküle paaren u. tauschen DNA-Stücke aus
  • Brechen u. Zsfügen gepaarter Teilstücke
  • mitwirkend: Einzelstrangbindeprotein (SSB) u. RecA-Protein
  • Vorgang beginnt, wenn Endonuklease DNA-Strang schneidet (Einzelstrangbruch)
  • gebrochener Stramg wird dr. Proteine m. Heilkaseaktivität v. anderem Strang getrennt
  • SSB binde an Einzelstrangfregment
  • RecA bindet an Einzelstrang –> ermglt. Verknüpfung m. komplementärem 2. Strang (Stranginvasion)
  • Basenpaarung v. je einem Strang –> D-Loop
  • Rekombizwischenprodukte: Heteroduplex –> Holliday-Str. (x-over)
  • verknüpfte Moleküle werden getrennt
  • je nach Ausrichtung der Holliday-Str. entstehen Patches od. Splices
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7
Q

Was ist Rec?

A
  • RecB: 3’-5’-Helicase u. Nuklease
  • RecD: 5’-3’-Helicase
  • RecDBC binden an dsDNA m. Chi-Sequenz
  • RecD wandert auf Strang m. 5’-Ende, RecB bei 3’-Ende –> entwinden sie
  • RecA bindet Strang m. 3’-Ende –> Austausch. m. homologer DNA (sucht Komplementarität unter ATP-Verbrauch)
  • RecBCD erreicht Ende u. alle UE werden frei
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8
Q

Was ist RuvABC?

A

RuvA: bindet an DNA –> Überkrezung
RuvB: ATPase –> Migration (Holliday-Struktur)
RuvC: Resolvase, schneidet Holliday-Struktur

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9
Q

Was ist Cre?

A
  • Rekombinase v. Balteriophage P1
  • erkennt loxP-site, bindet als Dimer daran
  • 2 Einschnitte: von jeder DNA wird Strang geschnitten u. m. anderem Strang verknüpft (Holliday)
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10
Q

Was ist der Unterschied zw. allg. und spezieller Transduktion?

A

allg. Transduktion: beliebige Region
- lyt. Prozess: Phage infiziert Donor –> Produktion neuer Phagen in Wirt –> transduzierende Partikel m. Wirts-DNA
- dann Transduktion: Partikel infiziert Reziepient –> homologe Rekombi –> transduzierende Rezepientenzelle

spezielle Transduktion: lysogenisierte Zelle, spezif. Stelle

  • normaler Ereignis: Phagen-DNA wird ringförmig, abgelöst u. repliziert –> Phagen-Replikation u. Lyse
  • selten: Teil der Wirts-DNA wird dr. Phagen-DNA ausgetauscht –> defekte Phagen, die best. Gene transduzieren können
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11
Q

Was ist genetische Kartierung? Welche Methoden gibt es?

A

–> Wo Insertion? Reihenfolge von Genen?

Transduktion, (Komplementation), Konjugation

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12
Q

Was ist das F-Plasmid?

A
  • Bakterien sind fähig zur Konjugation

Struktur:

  • OriT: Sequenz, an der Übertragung auf Rezepient mittels Rolling Circle beginnt
  • OriV: hier beginnt DNA-Replikation –> vermehrt F-Plasmid
  • tra: F-Pilus, Transferpore
  • IS: Abshcnitte, die ihre Kopien wo anders intergrieren können
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13
Q

Wie bez. man F+-Bakterien noch?

A

Hfr-Stämme (high frequency of recombination)

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14
Q

Wofür wird das F-Plasmid verwendet?

A
  • Ausbreitung v. Antibiotika-R

- Übertragung best. Gene

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15
Q

Wpfür nutzt man Interupted Pairing?

A
  • Hfr-Stamm überträgt F-Plasmid
  • nach untersch. langer Zeit: break apart (k. Pilus mehr) –> untersch. vl. Gene wurde übertragen
  • best. Gene werden früher übertragen als andere –> dadr. Länge der Gene auf Plasmid herausfindbar

zB gal-Gen wird als letztes übertragen –> kommt am wenigsten vor

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16
Q

Was ist die 2-Faktoren-Kreuzung?

A
  • Distanz zw. 2 makrern wird betrachtet

Donor: A+ B+
Rezepient: A- B-

mgl. Kombi: A+B- oder A+B+
- je weiter entfernt, desto kleine Frequenz, desto unwahrscheinlicher Crossing over

17
Q

Was ist die Wu-Formel?

A

C = (1 - d/L)^3

C - Co-Transduktionsfrequenz
L - Größe des transduzierenden Fragments [min oder Kb]

18
Q

Was ist die 3-Faktoren-Kreuzung?

A
  • 3 Marker werden betrachtet
mgl. Kombi:
A+ B+ C+
A+B+C-
A+B-C+ (sehr selten, da dopeltes x-over)
A+ B- C-
19
Q

Was ist die Komplementationsanalyse?

A
  • um Fkt. eines Gens zu finden
  • auch Kartierung
  • 2 Mutanten werden gekreuzt
  • Wildtypkombinante kann hervorgehen
  • 2 Kopien der DNA auf 2 versch. Molekülen
  • eine Mutation auf Chr., andere auf Plamid –> Mutationen sind trans
  • wenn auf untersch. Genen –> Empfängerzelle besitzt nichtmutierte Kopie eines jeden Gens –> WT-Phänotyp hergestellt
  • wenn auf gl. Gen –> negativer Phänotyp entsteht –> cis –> DNA-Molekül kann 2 DNA-Moleküle komplmentieren, wenn es für beide Gene WT-Eigenschaften besitzt, positive Kontrolle
  • Cis-Trans-Test (dadr. def. Gen: Cistrom)

Komplementation fkt. NUR, wenn Mutationen TRANS sind!

20
Q

Erkläre ein Bsp. der Komplementationsanalyse!

A 
Weisen Trp-Stämme auf gl. Gen eine Mutation auf?
3 Plasmide:
P1: A- B+
P2: A+ B1-
P3: A+ B2-

Mutanten:

1: A- B+
2: A+ B1-
3: A+ B2-

Kombis:
P1+1 = Trp-
P1+2 = Trp+
P2+3 = Trp+
P2+2: Trp-
P3+2 = Trp+
21
Q

Was ist T-POP?

A
  • Derivat von Tn10dTc
  • Terminator an tetA u./od. tetR entfernt –> Transkript, das v. tetA- u./od. tetR-Gen beginnt, wird in benachbarter DNA weitergeführt
  • überträgt Tet-R-Gen tetA, egal wo eingefügt
  • im Transposon wird tetR exprimiert –> TetR ist Repressor von tetA
22
Q

Was ist Tn10dTc?

A
  • reduzierte Form von Tn10

- die meisten IS10-Elemente u. das Transposase-Gen fehlen –> Transposase muss erst exprimiert werden

23
Q

Was macht das tetA-Gen?

A
  • Tet-R

- kodiert Membranprotein, das Tet aus Zelle pumpt –> Resistenz –> Wachstum trotz Tet

24
Q

Wie wird T-POP transduziert?

A

mit P22
- T-POP wird m. Wirtschr. verpackt u. auf rezepient übetragen

I. Transposase wird exprimiert: T-POP transponiert zu anderem Ort auf Chr. –> neue Insertionsmutation

II. Transposase nicht expr.: T-POP bleibt am gl. Ort u. wird dr. homologe Rekombi veerbt –> k. neue Mutation, aber im Rezipienten gl. Insertionsmutation

25
Q

Warum wird das F-Plasmid/pBR-Plasmid bei T-POP-Transduktion benötigt?

A
  • o. F-Plasmid: T-POP wird nicht vererbt –> k. Zellen mit Tet-R
  • o. pBR-Plasmid: k. Expr. v. Tn10-Transposase
26
Q

Wie kann T-POP zur Identifikation v. Flagellar-Genen verwendet werden?

A
  • Isolierung der T-POP-Insertionen, die das Flagellum-Gen fljB regulieren, über Selektion u. Screening

Selektion:

  • T-POP wird in Rezepient m. fljB::MudJ transduziert
  • MudJ: Km-R u. lac-Operon –> wenn im Gen eingefügt (über P22): Transkription der lac-Gene dr. fljB-Promotor –> (Expr. v. lac-Operon ist prop. zu Expr. v. fljB-Operon)
  • Expr. v. lacZ nachweisbar m. Indikatorplatte u. beta-Galaktosidase Assay

Screening:
- Selektion m. Tet-R: die wachsenen Stämme haben T-POP geerbt
- Lac- ohne Tc u. Lac+ m. Tc: tetA-Promotor in T-POP expr. positive Regulation v. fljB
Lac- unabh. v. Tc: T-POP im Gen fpr Zssetzung des HBB od. TF für Expr. v. fljB

27
Q

Was wir mit dem Luria-Delbrück-Test getestet?

A

2 Hypothesen:
I. zufällige Mutation (unabh. v. äußeren Einflüssen)
II. adaptive Immunität (adaptive Antwort auf Stimulus)

  • Kulturen auf Platten m. Phagen –> überlebende Kolonien werden gezählt u. Berechnung der Mutationsrate

Auswertung:
- wenn I. richtig: Mutation vor Kontakt –> Zahl variiert stark (frühe od. späte Mutation)
wenn II. richtig: Mutation nur bei Kontakt –> wenige Mutationen

28
Q

Wie wird die Mutationsrate berechnet?

A

Zahl an Mutation/Kultur: m = -ln(p0)
Wahrsch. für k. Mutanten: p0 = e(^-m)
Mutationsrate: a = m/Nt
Nt - Kultur

29
Q

Was ist die Lambda-Red-Rekombination?

A
  • Lambda-Red-Rekombinase-System des Phagen Lambda
  • Zielgen, dass VF kodiert, kann gestört werden durch Austausche m. tetR u. tetA –> Tet-R

3 Proteine:
Exo: verkürzt DNA am 5’-Ende –> Mononukleotide entstehen
Bet: Invasion komplementärer DNA
Gam: inhibiert RecBCD-Nukleasen u. schützt so Enden vor Degradation

  • tetA-Kassette kann per Elektroporation eingefügt werden (über P22 m. Plasmid pKD46) –> Expression der Lambda-Red-Enzyme u. Tet-R
  • Lambda-Rekombi v. Antibiotika-R-Dragment stört das Zielgen u. über die Resistenz ist eine positive Selektion der Mutanten m. der Störung mgl.
30
Q

Was ist Elektroporation?

A
  • dr. elekr. Feld wird Zellmembran permeabel
  • Elektroporator m. Küvettenplatz in der Mitte für Zellsuspension
  • Küvette hat 2 Elektroden
31
Q

Was ist PCR?

A
  • Vervielfältigen von DNS m. DNAP
    0. Denauturierung 95 °C 3 min
  1. Denauturierung
    - 94-96 °C 3 30 sec –> dsDNA zu Einzelsträngen
  2. Primerhybridisierung
    - Abkühlen aug 49 °C 30 sec
    - Primer lagern sich an
  3. Elongation/Polymerisation
    - 72 °C 2 min
    - RNAP wandert an Einzelstränge lang u. bildet neue dsDNAs
    - insgesamt 30 x Wiederholen
  4. final extension
    - 72 °C 8 min
32
Q

Wie wird die Infusionsrate berechnet?

A

[% Input] = ((CFU/mL Output)/(mean CFU/mL Input)) * 100

33
Q

Wie funktioniert SDS-PAGE ?

A
  • Trennung nach Molekülmasse in einem elektr. Feld
  • Gelelektrophorese
  • Trennmedium: Gel
  • Gel wird hergestellt
  • zu der Probe wird SDS als Puffer hinzugegeben
  • Elektrophoresekammer: Proben werden in die Taschen im Gel pipettiert
  • Größenmarker/Kontrolle in erste od. letzte Tasche
  • elektr. Spannung –> Moleküle wandern (je größer desto langsamer)
  • bei SDS-PAGE: Proteine wandern zuerst in ein Sammelgel, dann in ein Trenngel
  • Elektrolyt m. SDS
  • Anfärben der Banden
  • Bandenmuster wird analysiert
34
Q

Was ist ein Luciferase Assay?

A
  • Promotoren aus den 3 Klassen wurden m. einem LucCDABE Operon o. Promotor fusioniert, dieses Operon kodiert für LuxAB (Luciferase) u. LuxCDE
  • bei O2: LuxAB-Luciferase oxidiert Substrate, die v. LuxCDE bereitgestellt werden –> Lumineszenz
  • -> Licht als Antwort auf Genexpression, kann gemessen werden
  • Probe + Tet als Übernachtkulturen
  • OD600 wird gemessen v. Verdünnung
  • Probe un 96 Well Plate
  • Lumineszenz wird gemessen
35
Q

Was ist ein Western Blot?

A
  • Nachweis v. Proteinen in einem Gemisch
  1. Proteine werden mit SDS-PAGE aufgetrennt
  2. Banden werden aus Gel auf eine feste Membran übertragen (Blotting) mithilfe eine Elelktrophoresekammer
    - elektr. Spannung –> Banden wandern aus Gel in Membran
36
Q

Wie funktioniert Fluoreszenz-Mikroskopie?

A
  • Moleküle absorbieren Photonen –> e- auf höheres Level, dann wieder runter auf Gundlevel –> Vibrationsenergie geht verloren –> Emissionsspektrum ändert sich (längere Wellenlänge –> Energeiverlust) –> Molekül entlässt Licht, das gemessen wird
37
Q

Wie funktioniert Immunolabeling?

A
  • rote Bakterien dr. Plasmid pF48 m. mCherry-Protein
  • primäre Antikörper gegen Flagellin dekorieren Filament
  • sekundäre Antikörper gegen primäre, sind an grüne Fluorophore gebunden (Alexa Fluor 488)
  • -> grüne Filamente unter Mikroskop

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