Genetische Methoden Flashcards
Was ist eine Transformation?
DNA wird vom Spender fregesetzt und von Empfänger aufgenommen
Was ist das Griffith Experiment?
Stepptococcus pneumonia: können mit Schleimkapseln (smooth) Körper infizieren, R-Mutanten isoliert: ohne Hülle (rough) nicht mgl.
- dr. Hitze abgetötete S-Zellen + R-Zellen in Mäuse injiziert
- aus toter Maus isoliert: lebene S-Zellen
- aus toten S-Zellen DNA zur Kapselbildung freigesetzt und in R-Zellen aufgenommen –> Transformation zu S-Zellen
- Elektroporation fördert Transformation
Was ist Transduktion?
Übertragen v. DNA mit Bakteriophagen
Erkläre die allgemeine Transduktion?
- lyt. Zyklus
- beliebige Region des Wirts-Genoms wird übertragen
- Wirts-DNA wird anstelle des Virusgenoms in Phagenkopf gepackt
- Enzyme, die für das Verpacken viraler DNA verantwortl. sind, packen manchmal Wirt-DNA in Kopf –> Virionen (transduzierende Partikel) entstehen: führen nicht zur Virusinfektion, sind defekt
- Lyse –> defekte Phagen werden m. normalen Phagen freigesetzt –> Lysat erhält Mix aus beidem –> die meisten Zellen werden m. normalen Phagen infiziert
Was ist Konjugation?
Plasmid -od Chromosomenübertragung
- genet. Transfer dr. Zell-zuZell-Kontakt
- v. Plasmiden genutzt, um Kopien von sich selbst auf Wirt zu transferieren
- F-Plasmid: hat Region m. Genen zur Regulation der DNA-Replikation, hat transponierbare Elemente, durch die Plasmid in Wirtschromosom eindringen kann (Transferfkt.)
- Plasmid-DNA wird gebrochen u. zu Empfänger (F-) transportiert –> in Empfänger Synthese des Komplementärstranges –> beide haben vollständige Plasmdie nach Rekombi
Was ist homologe Rekombi?
- homologe DNA-Moleküle paaren u. tauschen DNA-Stücke aus
- Brechen u. Zsfügen gepaarter Teilstücke
- mitwirkend: Einzelstrangbindeprotein (SSB) u. RecA-Protein
- Vorgang beginnt, wenn Endonuklease DNA-Strang schneidet (Einzelstrangbruch)
- gebrochener Stramg wird dr. Proteine m. Heilkaseaktivität v. anderem Strang getrennt
- SSB binde an Einzelstrangfregment
- RecA bindet an Einzelstrang –> ermglt. Verknüpfung m. komplementärem 2. Strang (Stranginvasion)
- Basenpaarung v. je einem Strang –> D-Loop
- Rekombizwischenprodukte: Heteroduplex –> Holliday-Str. (x-over)
- verknüpfte Moleküle werden getrennt
- je nach Ausrichtung der Holliday-Str. entstehen Patches od. Splices
Was ist Rec?
- RecB: 3’-5’-Helicase u. Nuklease
- RecD: 5’-3’-Helicase
- RecDBC binden an dsDNA m. Chi-Sequenz
- RecD wandert auf Strang m. 5’-Ende, RecB bei 3’-Ende –> entwinden sie
- RecA bindet Strang m. 3’-Ende –> Austausch. m. homologer DNA (sucht Komplementarität unter ATP-Verbrauch)
- RecBCD erreicht Ende u. alle UE werden frei
Was ist RuvABC?
RuvA: bindet an DNA –> Überkrezung
RuvB: ATPase –> Migration (Holliday-Struktur)
RuvC: Resolvase, schneidet Holliday-Struktur
Was ist Cre?
- Rekombinase v. Balteriophage P1
- erkennt loxP-site, bindet als Dimer daran
- 2 Einschnitte: von jeder DNA wird Strang geschnitten u. m. anderem Strang verknüpft (Holliday)
Was ist der Unterschied zw. allg. und spezieller Transduktion?
allg. Transduktion: beliebige Region
- lyt. Prozess: Phage infiziert Donor –> Produktion neuer Phagen in Wirt –> transduzierende Partikel m. Wirts-DNA
- dann Transduktion: Partikel infiziert Reziepient –> homologe Rekombi –> transduzierende Rezepientenzelle
spezielle Transduktion: lysogenisierte Zelle, spezif. Stelle
- normaler Ereignis: Phagen-DNA wird ringförmig, abgelöst u. repliziert –> Phagen-Replikation u. Lyse
- selten: Teil der Wirts-DNA wird dr. Phagen-DNA ausgetauscht –> defekte Phagen, die best. Gene transduzieren können
Was ist genetische Kartierung? Welche Methoden gibt es?
–> Wo Insertion? Reihenfolge von Genen?
Transduktion, (Komplementation), Konjugation
Was ist das F-Plasmid?
- Bakterien sind fähig zur Konjugation
Struktur:
- OriT: Sequenz, an der Übertragung auf Rezepient mittels Rolling Circle beginnt
- OriV: hier beginnt DNA-Replikation –> vermehrt F-Plasmid
- tra: F-Pilus, Transferpore
- IS: Abshcnitte, die ihre Kopien wo anders intergrieren können
Wie bez. man F+-Bakterien noch?
Hfr-Stämme (high frequency of recombination)
Wofür wird das F-Plasmid verwendet?
- Ausbreitung v. Antibiotika-R
- Übertragung best. Gene
Wpfür nutzt man Interupted Pairing?
- Hfr-Stamm überträgt F-Plasmid
- nach untersch. langer Zeit: break apart (k. Pilus mehr) –> untersch. vl. Gene wurde übertragen
- best. Gene werden früher übertragen als andere –> dadr. Länge der Gene auf Plasmid herausfindbar
zB gal-Gen wird als letztes übertragen –> kommt am wenigsten vor
Was ist die 2-Faktoren-Kreuzung?
- Distanz zw. 2 makrern wird betrachtet
Donor: A+ B+
Rezepient: A- B-
mgl. Kombi: A+B- oder A+B+
- je weiter entfernt, desto kleine Frequenz, desto unwahrscheinlicher Crossing over
Was ist die Wu-Formel?
C = (1 - d/L)^3
C - Co-Transduktionsfrequenz
L - Größe des transduzierenden Fragments [min oder Kb]
Was ist die 3-Faktoren-Kreuzung?
- 3 Marker werden betrachtet
mgl. Kombi: A+ B+ C+ A+B+C- A+B-C+ (sehr selten, da dopeltes x-over) A+ B- C-
Was ist die Komplementationsanalyse?
- um Fkt. eines Gens zu finden
- auch Kartierung
- 2 Mutanten werden gekreuzt
- Wildtypkombinante kann hervorgehen
- 2 Kopien der DNA auf 2 versch. Molekülen
- eine Mutation auf Chr., andere auf Plamid –> Mutationen sind trans
- wenn auf untersch. Genen –> Empfängerzelle besitzt nichtmutierte Kopie eines jeden Gens –> WT-Phänotyp hergestellt
- wenn auf gl. Gen –> negativer Phänotyp entsteht –> cis –> DNA-Molekül kann 2 DNA-Moleküle komplmentieren, wenn es für beide Gene WT-Eigenschaften besitzt, positive Kontrolle
- Cis-Trans-Test (dadr. def. Gen: Cistrom)
Komplementation fkt. NUR, wenn Mutationen TRANS sind!
Erkläre ein Bsp. der Komplementationsanalyse!
Weisen Trp-Stämme auf gl. Gen eine Mutation auf? 3 Plasmide: P1: A- B+ P2: A+ B1- P3: A+ B2-
Mutanten:
1: A- B+
2: A+ B1-
3: A+ B2-
Kombis: P1+1 = Trp- P1+2 = Trp+ P2+3 = Trp+ P2+2: Trp- P3+2 = Trp+
Was ist T-POP?
- Derivat von Tn10dTc
- Terminator an tetA u./od. tetR entfernt –> Transkript, das v. tetA- u./od. tetR-Gen beginnt, wird in benachbarter DNA weitergeführt
- überträgt Tet-R-Gen tetA, egal wo eingefügt
- im Transposon wird tetR exprimiert –> TetR ist Repressor von tetA
Was ist Tn10dTc?
- reduzierte Form von Tn10
- die meisten IS10-Elemente u. das Transposase-Gen fehlen –> Transposase muss erst exprimiert werden
Was macht das tetA-Gen?
- Tet-R
- kodiert Membranprotein, das Tet aus Zelle pumpt –> Resistenz –> Wachstum trotz Tet
Wie wird T-POP transduziert?
mit P22
- T-POP wird m. Wirtschr. verpackt u. auf rezepient übetragen
I. Transposase wird exprimiert: T-POP transponiert zu anderem Ort auf Chr. –> neue Insertionsmutation
II. Transposase nicht expr.: T-POP bleibt am gl. Ort u. wird dr. homologe Rekombi veerbt –> k. neue Mutation, aber im Rezipienten gl. Insertionsmutation
Warum wird das F-Plasmid/pBR-Plasmid bei T-POP-Transduktion benötigt?
- o. F-Plasmid: T-POP wird nicht vererbt –> k. Zellen mit Tet-R
- o. pBR-Plasmid: k. Expr. v. Tn10-Transposase
Wie kann T-POP zur Identifikation v. Flagellar-Genen verwendet werden?
- Isolierung der T-POP-Insertionen, die das Flagellum-Gen fljB regulieren, über Selektion u. Screening
Selektion:
- T-POP wird in Rezepient m. fljB::MudJ transduziert
- MudJ: Km-R u. lac-Operon –> wenn im Gen eingefügt (über P22): Transkription der lac-Gene dr. fljB-Promotor –> (Expr. v. lac-Operon ist prop. zu Expr. v. fljB-Operon)
- Expr. v. lacZ nachweisbar m. Indikatorplatte u. beta-Galaktosidase Assay
Screening:
- Selektion m. Tet-R: die wachsenen Stämme haben T-POP geerbt
- Lac- ohne Tc u. Lac+ m. Tc: tetA-Promotor in T-POP expr. positive Regulation v. fljB
Lac- unabh. v. Tc: T-POP im Gen fpr Zssetzung des HBB od. TF für Expr. v. fljB
Was wir mit dem Luria-Delbrück-Test getestet?
2 Hypothesen:
I. zufällige Mutation (unabh. v. äußeren Einflüssen)
II. adaptive Immunität (adaptive Antwort auf Stimulus)
- Kulturen auf Platten m. Phagen –> überlebende Kolonien werden gezählt u. Berechnung der Mutationsrate
Auswertung:
- wenn I. richtig: Mutation vor Kontakt –> Zahl variiert stark (frühe od. späte Mutation)
wenn II. richtig: Mutation nur bei Kontakt –> wenige Mutationen
Wie wird die Mutationsrate berechnet?
Zahl an Mutation/Kultur: m = -ln(p0)
Wahrsch. für k. Mutanten: p0 = e(^-m)
Mutationsrate: a = m/Nt
Nt - Kultur
Was ist die Lambda-Red-Rekombination?
- Lambda-Red-Rekombinase-System des Phagen Lambda
- Zielgen, dass VF kodiert, kann gestört werden durch Austausche m. tetR u. tetA –> Tet-R
3 Proteine:
Exo: verkürzt DNA am 5’-Ende –> Mononukleotide entstehen
Bet: Invasion komplementärer DNA
Gam: inhibiert RecBCD-Nukleasen u. schützt so Enden vor Degradation
- tetA-Kassette kann per Elektroporation eingefügt werden (über P22 m. Plasmid pKD46) –> Expression der Lambda-Red-Enzyme u. Tet-R
- Lambda-Rekombi v. Antibiotika-R-Dragment stört das Zielgen u. über die Resistenz ist eine positive Selektion der Mutanten m. der Störung mgl.
Was ist Elektroporation?
- dr. elekr. Feld wird Zellmembran permeabel
- Elektroporator m. Küvettenplatz in der Mitte für Zellsuspension
- Küvette hat 2 Elektroden
Was ist PCR?
- Vervielfältigen von DNS m. DNAP
0. Denauturierung 95 °C 3 min
- Denauturierung
- 94-96 °C 3 30 sec –> dsDNA zu Einzelsträngen - Primerhybridisierung
- Abkühlen aug 49 °C 30 sec
- Primer lagern sich an - Elongation/Polymerisation
- 72 °C 2 min
- RNAP wandert an Einzelstränge lang u. bildet neue dsDNAs
- insgesamt 30 x Wiederholen - final extension
- 72 °C 8 min
Wie wird die Infusionsrate berechnet?
[% Input] = ((CFU/mL Output)/(mean CFU/mL Input)) * 100
Wie funktioniert SDS-PAGE ?
- Trennung nach Molekülmasse in einem elektr. Feld
- Gelelektrophorese
- Trennmedium: Gel
- Gel wird hergestellt
- zu der Probe wird SDS als Puffer hinzugegeben
- Elektrophoresekammer: Proben werden in die Taschen im Gel pipettiert
- Größenmarker/Kontrolle in erste od. letzte Tasche
- elektr. Spannung –> Moleküle wandern (je größer desto langsamer)
- bei SDS-PAGE: Proteine wandern zuerst in ein Sammelgel, dann in ein Trenngel
- Elektrolyt m. SDS
- Anfärben der Banden
- Bandenmuster wird analysiert
Was ist ein Luciferase Assay?
- Promotoren aus den 3 Klassen wurden m. einem LucCDABE Operon o. Promotor fusioniert, dieses Operon kodiert für LuxAB (Luciferase) u. LuxCDE
- bei O2: LuxAB-Luciferase oxidiert Substrate, die v. LuxCDE bereitgestellt werden –> Lumineszenz
- -> Licht als Antwort auf Genexpression, kann gemessen werden
- Probe + Tet als Übernachtkulturen
- OD600 wird gemessen v. Verdünnung
- Probe un 96 Well Plate
- Lumineszenz wird gemessen
Was ist ein Western Blot?
- Nachweis v. Proteinen in einem Gemisch
- Proteine werden mit SDS-PAGE aufgetrennt
- Banden werden aus Gel auf eine feste Membran übertragen (Blotting) mithilfe eine Elelktrophoresekammer
- elektr. Spannung –> Banden wandern aus Gel in Membran
Wie funktioniert Fluoreszenz-Mikroskopie?
- Moleküle absorbieren Photonen –> e- auf höheres Level, dann wieder runter auf Gundlevel –> Vibrationsenergie geht verloren –> Emissionsspektrum ändert sich (längere Wellenlänge –> Energeiverlust) –> Molekül entlässt Licht, das gemessen wird
Wie funktioniert Immunolabeling?
- rote Bakterien dr. Plasmid pF48 m. mCherry-Protein
- primäre Antikörper gegen Flagellin dekorieren Filament
- sekundäre Antikörper gegen primäre, sind an grüne Fluorophore gebunden (Alexa Fluor 488)
- -> grüne Filamente unter Mikroskop
