Génétique - Chapitre 9 Flashcards
1
Q
Nommer quelques traits faisant état de la variabilité génétique dans les populations
A
- pouce normal vs hitchhiker
- ligne de cheveux en V
- fossettes
- lobe d’oreille collé vs détaché
- langue enroulée
2
Q
Quelle proportion des paires de bases est commune entre 2 individus?
A
99,8%
donc, 1pb différente pour chaque 1000pb entre 2 individus
3
Q
Quelle est la nature des différences génétiques dans la population?
A
- single nucleotide polymorphism (SNP): 1 différence chaque centaine de pb
- courts indel (insertion/délétion): 1 différence chaque kb
- microsatellites: (A)n, 1 chaque quelques kb
- minisatellites: (ATCGCCAT)n, 1 chaque quelques kb
- gènes répétés
- larges inversions, délétions
4
Q
Quelle est la différence entre polymorphisme et mutation?
A
- SNP: variation d’une base retrouvée >1%
- mutation: variation d’une base retrouvée <1%
5
Q
Qu’est-ce qu’un allèle majeur vs mineur concernant les SNPs?
A
- majeur: fréquence allélique > 50%
- mineur: fréquence allélique < 50%
6
Q
Qu’est-ce qu’un haplotype?
A
- variation d’allèle sur un seul chromosome
- groupe de SNPs liés sur le même segment chromosomique
7
Q
Que peuvent engendrer les SNPs codant?
A
le changement d’une paire de base peut ne pas avoir d’impact (même AA, ou même propriétés), ou encore donner une protéine différente voir non fonctionnelle (changement AA)
8
Q
Quels sont les types de SNPs?
A
- SNP codants (concerne les exons)
- SNP régulateur (dans le gène)
- SNP intronique
- SNP génomique (hors gène)
9
Q
Est-ce possible pour une même population d’être polymorphe et monomorphe?
A
oui, on peut être polymorphe pour un caractère donné et monomorphe pour un autre
un caractère polymorphe dans une pop peut être monomorphe dans une autre pop
l’état polymorphe ou monomorphe est caractéristique d’un gène (ou une portion non codante de l’ADN) et d’une population
10
Q
Quelle mutation confère une protection contre le VIH? Comment ça fonctionne?
A
- del32 (CCR5)
- il y a plus de 20 variantes de CCR5
- les hétérozygotes del32(CCR5)/CCR5 ont une protection naturelle contre le SIDA
- homozygotes del32(CCR5)/del32(CCR5) résistent à l’infection
- pour être infecté, le virus utilise les récepteurs CD4 et CCR5 pour infecter la cellule. Si le CCR5 ne fonctionne pas, l’infection n’a pas lieu
11
Q
Que sont les maladies complexes?
A
maladies guidées par plusieurs gènes et l’environnement
12
Q
Que permettent les études d’association? Quels sont les différents design?
A
- détection d’une association entre des variantes génétiques et la maladie à travers des familles
- associer gène/SNP à maladie/phénotype
- design cas-contrôle
- design de cohorte
- design familial: trio parental (père/mère/enfant atteint)
13
Q
Qu’est-ce qu’une étude d’association pangénomique? Quels sont les avantages/inconvénients?
A
- étude libre d’hypothèse: on découvre
- analyse de nombreuses variations génétiques chez de nombreux individus pour étudier leurs corrélations avec des traits phénotypiques
- coût élevé, car grand besoin en génotypage
- correction pour analyses multiples (plusieurs faux positifs, peu de cibles manquées)
14
Q
Qu’est-ce qu’une étude d’association gène candidat?
A
- basée sur une hypothèse
- faible coût: petit besoin en génotypage
- moins d’impact de la correction statistique (plus de cibles manquées, moins de faux positifs)
- on observe ce qui est semblable entre ceux qui sont atteints
15
Q
Quels facteurs peuvent mettre à risque de cancer du à une mutation de p53?
A
- genre et ethnie
- état de santé
- nutrition
- jeune âge
- gène polymorphes
16
Q
Comment évaluer le risque de cancer en pratique?
A
- échantillons entre 100 et 1000
- génotypage avec des chips commerciales (affymetrix ou illumina)
- analyse statistiques pour chaque SNP et calcul de la valeur p pour chaque SNP
17
Q
Qu’est-ce que la pharmacogénomique?
A
branche de la génétique qui s’intéresse au rôle de la génétique dans la variabilité de réponse aux médicaments et au développement d’effets secondaires entre individus
18
Q
Pourquoi est-ce important d’identifier les variantes génétiques avant de prescrire?
A
- détecter les individus qui auront des effets non-désirés
- déterminer la dose appropriée
- détecter les individus dont le médicament n’aidera pas
19
Q
Dans une chimiothérapie personnalisée pour des patients ayant tous le même diagnostic, quelles sont les possibilités d’issues pour les patients?
A
- répondeurs sans toxicité: traitement conventionnel (médicament ou dose)
- répondeurs avec toxicité pour un traitement alternatif
- non répondeurs pour le traitement alternatif
20
Q
Qu’est-ce que la pharmacodynamique?
A
- étudie les effets des médicaments sur les organismes sains
- transporteurs, récepteurs et métabolismes
- étude détaillée de l’interaction du médicament sur sa cible
21
Q
Qu’est-ce que la pharmacocinétique?
A
- manière dont le médicament se comporte dans l’organisme, parcours du médicament
- Absorption, Distribution, Métabolisme, Excrétion
22
Q
Quels paramètres pharmacodynamiques peuvent être modifiés par le polymorphisme?
A
- déficit en enzymes (glucose 6p DH, enzyme de conversion de l’angiotensine)
- déficit en récepteurs
23
Q
Quelles sont les 2 phases d’enzymes du métabolisme polymorphe?
A
Phase 1: modification des groupements fonctionnels, métabolisme oxydatif
ex: cytochrome P450, alcool/aldéhyde désydrogénase
Phase 2: conjugaison avec un substrat endogène
ex: thiopurine méthyltransférase (TMPT)
24
Q
Par quoi est causé le syndrome du rougissement asiatique?
A
- individus homozygotes pour le déficit en aldéhyde déshydrogénases: processus du métabolisme de l’alcool beaucoup plus lent
- après consommation d’alcool, ce déficit enzymatique provoque une vasodilatation générale, le corps adopte alors une mécanisme de défense semblable une allergie à l’alcool (rougissement, céphalées, vomissement, augmentation rythme cardiaque)
- présent chez les tiers des asiatiques
25
Qu'est-ce que le cytochrome P450?
- plus gros complexe du métabolisme des médicaments
- le même médicament peut être plus ou moins métabolisé par plusieurs isoformes: famille CYP
- les gènes qui codent les CYP sont polymorphes
- 57 gènes codant les P450 découvert par le séquençage du génome
- parmi lesquels 15 ont un rôle encore inconnu
26
Expliquer le rôle de TPMT
- principale voie d'inactivation intracellulaire des thiopurines (métabolisme des bases ADN)
- utilisées pour le traitement de différentes maladies
- phénotype de l'activité de TPMT suit une hérédité autosomale
- déficience en TPMT liée à une toxicité hématopoïétique
- voie candidate: méthotrexate, au lieu de 6-mercaptopurine et azathioprine
27
Quelle est la distribution dans la population de l'activité de la TPMT dans les globules rouges?
- 89% des sujets présentent une activité TPMT élevée/haute, associée à la présence de 2 versions sauvages du gène
- 11% activité intermédiaire, associée à la présence d'un variant allélique à l'état hétérozygote
- 0,3% activité indétectable, associée à la présence de 2 variants alléliques à l'état homozygote
28
Ou se situe le gène de la TPMT? Quels sont les polymorphismes fonctionnels les plus fréquents?
- sur le chromosome 6
- allèles TPMT*2, TPMT*3A ou TPMT*3C
29
Expliquer la source de variabilité des effets de l'Azathioprine et du 6-MP
- patients ayant un déficit partiel en TPMT ont un risque important de toxicité hématologique et devraient recevoir une dose initiale réduite à 30-70% de la posologie standard
- patients ayant déficit complet en TPMT ne devraient pas recevoir d'azathioprine, car risque majeur d'aplasie médullaire (diminution de production de cellules sanguines)
30
Que fait TPMT? Quels médicaments sont méthylés par cette enzyme?
- enzyme de phase 2 qui ajoute un radical méthyl à ses substrats (enzyme de conjugaison)
- on ne connait pas de substrat endogène
- les 3 médicaments: azathioprine, 6-mercaptopurine et thioguanine = cytotoxique
31
Pour quoi sont utilisées l'azathioprine, la 6-mercaptopurine et la thioguanine?
- anticancéreux dans le traitement de consolidation des leucémies aigues lymphocytaires de l'enfant
- immunosuppresseurs en greffe rénale
- maladie de Crohn
- maladies auto-immunes
32
Comment sont désactivés l'azathioprine, la 6-mercaptopurine et la thioguanine?
par la S-méthylation
33
Comment évaluer l'activité de la TPMT?
- mesurable dans les globules rouges
- évaluer via phénotypage ou mesure des taux sanguins du métabolite inactif 6-méthylmercaptopurine et du métabolite toxique 6-thioguanine
- chez les sujets déficients en TPMT, le risque est l'hématotoxicité
34
Qu'entraîne une faible activité de TPMT?
accumulation d'un sous-produit, N6TG, toxique pour la moelle osseuse
35
Est-ce possible d'avoir une trop grande activité de TMPT?
oui, plus rare, et ne répondent pas à des doses normales du médicament
36
Quelle est la chaine de réaction du TMPT et des médicaments?
1. l'azathioprine peut devenir du 6-mercaptopurine
2. 6-mercaptopurine, avec TMPT, devient 6-méthyl mercaptopurine, inactif, qui sera évacué
3. le 6-mercaptopurine subit quelques réactions et devient du 6-thioguanine nucléotides, toxique, et qui s'accumule si TMPT déficiente
4. 6-TGN, analogue à une purine/pyrimidine, est incorporé dans la cellule/ADN, associé à l'inhibition de Rac1 provoquée par le nucléotide 6-TGTP, induit l'apoptose cellulaire, à l'origine de la cytotoxicité et l'immunosuppression
37
Quel est le lien entre azathioprine et 6-mercaptopurine?
- azathioprine est une pro-drogue de la 6-mercaptopurine, qui est analogue d'une base purique de l'ADN
38
Qu'Est-ce que le MTX?
- méthotrexate
- antifolate qui pénètre dans les cellules par une voie de transport actif des folates réduits
39
Expliquer l'utilisation du MTX en présence d'une déficience en TPMT?
- MTX transformé en métabolites intracellulaires polyglutamatylés (MTX-PG) par FPGS
- activité MTX fondée sur l'inhibition de la DHFR, entrainant une inhibition de la réduction du DHFR en tétrahydrofolate, la forme active
- inhibition de la voie des folates dès la première étape, les folates étant indispensable à la synthèse de novo des purines et de la thymidine
- MTX inhibe également la thymidilate synthase (TS), ainsi que l'amidophosphoribosyl transférase, autre enzyme impliquée dans la synthèse de novo des bases puriques
40
Qu'est-ce que le diagnostic moléculaire?
diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d'un gène, de plusieurs gènes (digénisme) ou de l'épigénome
41
Est-ce que la majorités des individus porte des variations dans son génome?
oui, la plupart sont silencieuses
42
Que sont des hotspots?
- région CG plus à risque pour les mutations
43
Par quoi est causée la majorité de la variabilité génétique?
des substitutions
44
Quelles sont les 2 causes de la variabilité génétique?
1. dommages externes: physiques (radiations, UV) ou chimiques
2. dommages internes: dépurination, déamination, radicaux libres, méthylation, erreur de la polymérase/réplication/recombinaison
45
Quelles sont les conséquences des mutations?
- homologues (silencieux)
- faux-sens (autre NT, donc autre AA), variable
- non-sens: codon stop, souvent patho
- altération du cadre de lecture
- changement du niveau d'expression (mutation du promoteur)
46
Quelles sont les techniques de détection de base dans le diagnostic moléculaire?
1. techniques sur l'ADN génomique, comme buvardage southern
2. techniques sur PCR
47
Quelles sont les différentes techniques sur PCR?
- migration PCR
- oligonucléotides allèle-spécifique
- digestion PCR
- allele-specific primer extension
- séquençage PCR
- PCR en temps réel
- MLPA
48
Qu'est-ce que la technique Southern Blot?
combine migration sur gel de l'ADN génomique fragmenté à la détection d'une séquence d'intérêt par une sonde marquée
49
Quelles sont les étapes de la Southern Blot?
1. digestion de l'ADN, avec des enzymes de restrictions = mélange de fragments de restriction
2. électrophorèse et migration sur gel de haut en bas en fonction inverse de leur taille
3. montage pour faire passer les fragments du gel sur une membrane de nylon ou l'ADN va se fixer par des liaisons stables
4. membrane de nylon avec l'ADN fixé est mise à incuber avec une sonde radioactive complémentaire du fragment de l'ADN recherché, à basse température pour que l'hybride se forme mais assez élevée pour que l'hybride soit parfaitement complémentaire
5. lave la membrane des molécules de la sonde pas fixées à l'ADN complémentaire, puis on la met en présence d'un film radiographique vierge dans une enceinte opaque pour que la sonde radioactive fixée sur les fragments de l'ADN complémentaires
6. film ou des taches noires correspondent aux emplacements ou ont migrés les fragments d'ADN complémentaires de la sonde
7.comparaison distances de migration avec des fragments d'ADN radioactif de tailles connues qui servent de marqueurs de taille
50
Dans le Southern Blot, que sont les RFLPs?
- restriction fragment length polymorphism
- présents dans toutes les séquences (codantes, non codantes, introns, exons)
- ce sont des variations dans la séquence d'ADN qui entraîne l'ajout ou le retrait des sites de restriction: polymorphisme de l'ADN
- on peut étudier la variation d'un gène dans une population ou entre les populations
51
Expliquer la technique PCR
1. on prend un double brin d'ADN
2. on dénature l'ADN en chauffant
3. ajout d'une amorce sur les brins simples
4. synthèse d'ADN sur chacun des brins par ADN polymérase thermostable
5. dénaturation du nouveau double brin
.....
on refait le cycle autant que voulu
52
Quels sont les ingrédients pour la technique PCR?
1. matrice ADN double brin
2. amorces oligonucléotidiques
3. 4 dNTP
4. ADN polymérase thermostable
53
Pour quoi doit-on alterner entre 3 températures dans la PCR?
1. température pour séparer l'ADN
2. diminution pour l'amorce
3. légère augmentation pour la réplication
54
Quelle est la formule pour déterminer le nombre de brin d'ADN après n cycle?
2 à la n
55
Qu'est-ce que la méthode allele specific oligonucléotides?
- PCR + Southern Blot
- hybridation avec des sondes spécifiques de la séquence mutée et de la séquence normale
56
Qu'est-ce que la technique de PCR digestion?
- digestion d'un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique
- mutation crée ou abolit le site de restriction
- utile pour interroger une région du génome variable en séquence
- vu la variabilité d'enzymes disponibles, habituellement possible de trouver un site de restriction créé ou annulé par la mutation recherchée
57
Qu'est-ce que la technique Allele specific primer extension?
- amplification PCR
- mismatch 3' des amorces marquées
- s'il y a un match entre l'amorce et le brin d'ADN, on a une extension
- si non, pas d'extension
58
Comment peut-on séquencer l'ADN?
- dNTPs: OH en 3', pas en 2'
- ddNTPs: pas de OH en 3' ni en 2'
- l'absence de OH sur ddNTPs empêche la liaison du prochain dNTP
dans 4 éprouvettes, on place ADN + amorces + 4 dNTP + Taq polymérase.
chaque éprouvette comprend soit ddATP, ddCTP, ddTTP ou ddGTP
on obtient un mélange de fragment de taille différente avec la même fin
59
Dans quelles situations le séquençage d'ADN est-il pertinent?
- substitutions
- bonne méthode pour petites insertions ou délétions
60
Comment fonctionne la PCR en temps réel?
- utilise le principe de base de la PCR classique, avec pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel
- analyse quantitative
- on fixe un seuil arbitraire (unités relatives de fluorescence) pour tous les patients
- quantité ADN double à chaque cycle
61
Pourquoi la fluorescence du PCR atteint un plateau?
car plus on fait d'ADN, plus on libère de pyrophosphate, qui inhibe l'ADN polymérase, donc après 32 cycles, on ne peut pas quantifier
62
Qu'est-ce que la technique Sybr green?
- colorant qui s'intercale dans l'ADN double brin
- technique pour PCR en temps réel
1.Sybr green, est fluorescent quand lié à un ADN double-brin
2. quand l'ADN est dénaturé, Sybr Green est libéré et la fluorescence est drastiquement réduite
3. durant l'extension, les amorces et des produits PCR sont générés
4. quand la polymérisation est complète, Sybr green se lie avec le produit double brin, on obtient une nette augmentation en fluorescence
63
Expliquer la technique taqman
- technique de PCR en temps réel
- on a un reporteur, qui émet de la lumière lorsqu'exposé à une longueur d'onde
- on a un quencher, qui empêche le reporteur d'émettre de la lumière
1. R et Q sont attaché à une sonde Taqman
2. quand la sonde est intact, Q capte les émissions de R
3. durant chaque extension de cycle, ADN pol coupe R de la sonde Taqman
4. une fois séparée de Q, le R émet sa fluorescence
64
Si le patient A atteint le seuil de PCR en 24 cycles, mais le patient B en 25 cycles, que peut-on conclure?
le patient A avait deux fois plus d'ADN au départ que le patient B
65
Qu'est-ce que MLPA?
- multiplex ligation-dependent probe amplification
- méthode de recherche de délétions/duplications
- sonde en 2 sous-unités (2 oligonucléotides) qui doivent s'hybrider côte-à-côte sur l'ADN du patient
- ligase scelle les 2 sous-unités
- amplification PCR
- électrophorèse capillaire
66
Quelles sont les étapes de MLPA?
1. dénaturation de l'ADN
2. hybridation de la séquence amorce de PCR et les séquences d'hybridation sur l'ADN cible
3. ligase entre les séquences d'hybridation
4. amplification PCR
5. séparation des fragments et analyse des données
67
Comment sépare-t-on les fragments du MLPA?
on sépare les fragments selon leur longueur grâce à l'électrophorèse capillaire
on observe les différentes longueurs sous forme de pic appelé un electropherogramme
68
Comment sont les nouvelles méthodes de séquençage d'ADN? Quel est le principe?
séquençage à haut débit
- principe: obtention de séquences courtes en très grand nombre
- 454 ou illumina
69
Quelles sont les étapes du séquençage d'ADN à haut débit?
1. fragmentation: taille cible
2. liaison d'adaptateurs et code barres
3. capture
4. amplification en parallèle
70
Comment préparer les échantillons d'ADN dans la technologie 454?
- fractionnement aléatoire de l'ADN en morceaux de 300-800pb pour ADN simple brin
- un fragment d'ADN (avec ses adaptateurs/codes-barres spécifiques) par bille
- émulsion des billes avec produits d'amplification
- PCR, amplification de chaque séquence
71
Comment fonctionne le séquençage d'ADN dans la technologie 454?
- purification des fragments sur place
- une bille par puits
- ajout d'enzyme de séquençage
- bases complémentaires du brin matrice s'ajoutent un à la fois
- séquençage avec émission de lumière
- PCR
72
Comment la technique 454 émet de la lumière?
- à chaque dNTP ajouté, un PPi est lâché
- synthèse d'ATP à partir de PPi
- hydrolyse de l'ATP par la luciférase
- luciférine est utilisée pour émettre de la lumière
73
Comment se nomme ce graphique des résultats suite à la technologie 454?
visible sur un flowgram
74
Comment fonctionne la technologie illumina?
- ensemble de molécules d'ADN+adaptateurs fixées sur une petite surface solide (biopuce)
- basé sur l'incorporation réversible de nucléotides fluorescents et par lecture optique de la fluorescence
- permet de séquencer en parallèle plus de 3 milliards de petits fragments d'ADN avec peu d'erreurs
75
Quelles sont les étapes de la technologie illumina?
1. génération d'une banque d'ADN double brin à partir de l'échantillon à analyser par fractionnement aléatoire en morceaux de 200pb
2. amplification de l'ADN en cluster
3. séquençage d'ADN
76
Comment l'ADN est amplifié dans la technologie illumina?
- ajout d'adaptateurs spécifiques aux extrémités reliés sur une lame = colonie de cluster
- dénaturation de l'ADN en simple brin
- fixation de l'extrémité des simples brins aléatoirement à la surface du flowcell
- PCR
- création d'un double brin
77
Comment est séquencé l'ADN dans la technologie illumina?
- réalisée directement sur le support ou l'ADN est amplifié
- nécessite de nombreuses copies d'ADN pour détecter signal lumineux
- basé sur arrêt de la synthèse d'ADN par utilisation d'un nucléotide terminateur fluorescent
- nucléotides marqués sont incorporés pour allonger le brin
- les nucléotides excédentaires sont retirés par lavage entre chaque réaction
- détection laser de la fluorescence est réalisé en temps réel
78
Comment peut-on attribuer les bonnes séquences au bon patient quand on séquence plusieurs patients en même temps?
- grâce au code-barre moléculaire
- on aligne les séquences au bon endroit du génome humain, ensuite on identifie s'il y a des variations de séquences
- déterminer si variations pathologiques
79
Quelles sont les applications du séquençage d'ADN à haut débit?
1. séquençage de l'exome
2. analyse de l'ADN foetal circulant
80
Qu'est-ce que le séquençage de l'Exome?
- capture et analyse des exons (partie codante du génome)
- on ne voit pas les introns, régions intergéniques...
