Fundamentos de tecnicas Flashcards
caracteristicas de la PCR
- herramienta tecnológica innovadora en el estudio de ácidos nucléicos
- Se caracteriza por una alta sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia
- Genera resultados confiables en poco tiempo y son fáciles de analizar
Hay 2 técnicas
- Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (cualitativa)
- Reacción en cadena de la polimerasa en timepo real (cuantitativas)
Que es la PCR?
es ua reacción enzimática en vitro que amplifica millones de veces una secuencia en blanco es copiada fielmente
elementos de la PCR
- El modelo de ADN o ADN complementario
- Enzima
- La desoxirribonucleótidos
- El ion de magnesio
- Oligonucleótidos: primers
- Solución amortiguadora buffer y H2O
Etapas de la PCR
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Equipo donde se realiza la PCR
termocicladores
mantienen sistema homogeneo de temperatura y tiempo necesarios
¿Como se comprueba que la PCR fue exitosa?
A traves de un analisis por electroforesis en geles de agaroza de las *amplificaciones
Que enzima usa la PCR?
Taq ADN polimerasa que provienen de una bacteria termófila llamada “thermus aquaticus”
Bac vive en temperaturas muy altas, su enzima es termoestable
soporta temperaturas muy altas
¿Que es un primer?
secuencias de oligonucleótidos que delimitan la secuencia blanco que desea amplificar *( son completamentarios a esta)
Se utilizan 2 primers forward (sentido) y reward (antisentido)
Que pasa en la desnaturalizacion?
PCR
Las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95° durante 20-30 s
El timepo depende de la secuencia del templado,
- Ejemplo: si la concentración de G-C es alta, entonces será necesario mas tiempo para romper sus uniones (ya que están formados por 3 enlaces y A-T solos dos)
Que pasa en la Hibridacion?
PCR
Los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
- La temperatura debe se entre 50-60° C
Primer correcto + Temp adecuada: complejo estable y eficiente
que pasa en la extension?
PCR
La Taq polimerasa agregua dntp’s al complejo templado-primers y empieza la función para crear las cadenas completas de ADN
- La extensión de las cadenas es en dirección e la síntesis del ADN, es decir, 5’ a 3’
- La temperatura óptima es de 72°C (para la Taq polimerasa)
**Al final del ciclo se habra formado los amplicones
electroforesis consiste en:
la separación de grandes moléculas como los ácidos nucléicos a través de una matriz sólida que funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica
Esta separación se hace bajo un buffer o tampón
Que pasa con los acidos nucleicos en electroforesis?
En el caso de los ácidos nucléicos, el grupo fosfato les otorga una carga negativa por lo que durante la electroforesis migran hacia el lado positivo
En la PCR en tiempo real se usa electroforesis?
Nop
caracteristicas de la PCR en tiempo real
cuantificar las secuencias especificas de ácidos nucleicos.
Hay detección de productos ya amplificados en cada uno de los pasos.
Es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos
- Aún con una pequeña cantidad de templado garantiza alta sensibilidad, especificidad y eficiencia
Elementos de la PCR en tiempo real
Los ingredientes son los mismos que en PCR en punto final,
- solo que enzima, los DNTP’S, Mg+, el buffer y el sistema de fluorescencia se venden por separado
- es libre de nucleasas
- los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar un alta específicas y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb
Para que sirven los termocicladores?
PCR
- Excitar el sistema de fluorescencia
- Capturar la señal de emisión del mismo
- Realizar el análisis cuantitativo
Ingredientes de la PCR en tiempo real
Máster mix
Agua
DTNPS
Buffer
Magnesio
Sistema de fluorescencia
Los termocicladores poseen un software que genera gráficas
- Una de estas gráficas es la de la amplificación que muestra el curso y El Progreso de la reacción,
- otro gráfica es la disociación que muestra la especificidad de la reacción
Tipos de cuantificacion de la PCR en tiempo real
- absoluta
- relativa
Para que sirve la cuantificacion absoluta:
Mide la cantidad exacta de copias amplificada o concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra
Ej: Para medir la carga viral o bacteriana
Cuando se usa la cuantificacion relativa?
Cuando se desea evaluar los cambios de expresión de los genes en distinto estado fisiológico
Ej: saber la expresión del gen
LA neta me falto un tema de estos apuntes pero ya me canse T.T
descansa
lo que falto fue el formato Fast A
