F6: Spektroskopi Flashcards
Peptidbindingens stærkeste absorption (bølgelængde)
190 nm
Peptidbindingens svagere absorption (bølgelængde)
210-220 nm
Tryptofans absoptions maksimum
296 nm
Tyrosins absoptions maksimum
274 nm
Phenylalanins absoptions maksimum
257 nm (svag intensitet)
Kromofor
Stof der absorberer lys
Proteiner kromoforer
Peptidbindingen
Aromater
Stærkt konjugerede dobbeltbindinger
Forklaring af absorption
Pi elektroner optager lyset og exciteres (hopper ud i en højere orbital, højere energiniveau)
Ikke alt lyset der kommer igennem, når man sender det igennem en opløsning
Lambert Beers lov
A = ε · C · l A absorbans ε eksinktionskoefficient/molære absorptionskoefficient [L/molcm] C koncentration [mol/L] l længde lyset rejser over [cm]
Antager at alle molekyler bidrager til absorbtionen
(må derfor ikke være nogen der skygger for de andre, gælder for lineære plots af A som fkt af C)
Ekstinktionskoefficienten ε
[L/molcm]
Høj betyder at strålingen hurtigt bliver absorberet
Lille at strålingen langsomt absorberes med koncentrationsstigningen
Fluorofor
Molekyle der udsender stråling (fluorescens)
Hopper til et højere energilevel (excited state) når de absorberer stråling. Noget af denne energi udsendes som stråling, når molekylet vender tilbage til et lavere energiniveau (dens ground state).
Stokes skifte
Energiforskellen mellem den laveste energi absorptionstop og den højeste energi emissionstop
Udtrykker hvor meget energi der er gået tabt
Baggrund for Stokes skifte
Energi vil altid være lavere når den vender tilbage = større bølgelængde af fluorescens end exciterende stråling
(Skyldes vibrationer, varmetab, interaktion med medie)
Bølgelængdens energi bruges til at ændre elektronbaner og atomspin
Foldede proteiners flourescens maksimum
335 nm
Udfoldede proteiners flourescens maksimum
356 nm (samme som tryptofans fluorescens maksimum)
Hvordan påvirker udfoldning flourescens?
Ændring af flourescens maksimum (335 nm -> 356 nm)
Fald i intensitet (det exciterede molekyle/den inducerede dipol interagerer med polært miljø, laver dipol-dipol vekselvirkninger - interaktion reducerer energien i molekylet)
Større Stokes skifte = mere polære omgivelser
Tryptofan er vigtig som.. fordi ..
Indikator for det omgivende miljø
Fordi Excitation af tryptofan fører til en stor stigning af dipolmomenten (x4) – derfor mere interaktion med miljøet (flere dipol-dipol vekselvirkninger ved polært miljø)
Rødskifte
Skifte mod længere bølgelængde (rødt spektrum) for emission
Tab af energi
Polær solvent
Blåskifte
Skifte mod kortere bølgelængde (blåt spektrum) for emission
Højere energi
Hydrofobt miljø
FRET
Flourescens Resonoans Energy Transfer
Kræver overlap af emissionsspektrum (don) og absorptionsspektrum (acc)
og en førsteafstand (under 5 Å)
To flouroforer internt i molekyler (Tyr og Trp spektre overlapper også) eller i forsk molekyler –
Kan sige noget om interaktion og intern dynamik
Quenching
Dæmpning af bølgens intensitet
Alle polære grupper (inkl disulfider) quencher Trp’s fluorescens
CD spektroskopi
Cirkulær dikroisme
Måler forskel i absorption ml højre- og venstredrejet lys
Chirale C og aromatiske sidekæder i asymmetriske miljøer er optisk aktive og skaber derfor skaber denne forskel
Siger derfor noget om backbone (sekundær struktur)
CD spektre
Unikke for sekundærstrukturer og for hvert protein
Alpha helix CD spektrum (min og maks)
Min:
222 og 208 nm
Maks:
192
Beta helix CD spektrum (min og maks)
Min:
216 nm
Maks:
195 nm
Random coil CD spektrum (min og maks)
Min:
200 nm
Maks:
212 nm
3 metoder til struktur bestemmelse
CryoEM (elektronmikroskopi)
NMR (Nucleat Magnetic Resonance)
X-ray krystallografi
Fordele og ulemper ved cryoEM
+
Kan se store proteiner, intet behov for krystaller?
-
Lav resolution
