F6: Spektroskopi

Question 1

Peptidbindingens stærkeste absorption (bølgelængde)

Answer 1

190 nm

Question 2

Peptidbindingens svagere absorption (bølgelængde)

Answer 2

210-220 nm

Question 3

Tryptofans absoptions maksimum

Answer 3

296 nm

Question 4

Tyrosins absoptions maksimum

Answer 4

274 nm

Question 5

Phenylalanins absoptions maksimum

Answer 5

257 nm (svag intensitet)

Question 6

Kromofor

Answer 6

Stof der absorberer lys

Question 7

Proteiner kromoforer

Answer 7

Peptidbindingen
Aromater
Stærkt konjugerede dobbeltbindinger

Question 8

Forklaring af absorption

Answer 8

Pi elektroner optager lyset og exciteres (hopper ud i en højere orbital, højere energiniveau)
Ikke alt lyset der kommer igennem, når man sender det igennem en opløsning

Question 9

Lambert Beers lov

Answer 9

A = ε · C · l
A absorbans 
ε eksinktionskoefficient/molære absorptionskoefficient [L/molcm]
C koncentration [mol/L]
l længde lyset rejser over [cm]

Antager at alle molekyler bidrager til absorbtionen
(må derfor ikke være nogen der skygger for de andre, gælder for lineære plots af A som fkt af C)

Question 10

Ekstinktionskoefficienten ε

Answer 10

[L/molcm]
Høj betyder at strålingen hurtigt bliver absorberet
Lille at strålingen langsomt absorberes med koncentrationsstigningen

Question 11

Fluorofor

Answer 11

Molekyle der udsender stråling (fluorescens)
Hopper til et højere energilevel (excited state) når de absorberer stråling. Noget af denne energi udsendes som stråling, når molekylet vender tilbage til et lavere energiniveau (dens ground state).

Question 12

Stokes skifte

Answer 12

Energiforskellen mellem den laveste energi absorptionstop og den højeste energi emissionstop
Udtrykker hvor meget energi der er gået tabt

Question 13

Baggrund for Stokes skifte

Answer 13

Energi vil altid være lavere når den vender tilbage = større bølgelængde af fluorescens end exciterende stråling
(Skyldes vibrationer, varmetab, interaktion med medie)
Bølgelængdens energi bruges til at ændre elektronbaner og atomspin

Question 14

Foldede proteiners flourescens maksimum

Answer 14

335 nm

Question 15

Udfoldede proteiners flourescens maksimum

Answer 15

356 nm (samme som tryptofans fluorescens maksimum)

Question 16

Hvordan påvirker udfoldning flourescens?

Answer 16

Ændring af flourescens maksimum (335 nm -> 356 nm)
Fald i intensitet (det exciterede molekyle/den inducerede dipol interagerer med polært miljø, laver dipol-dipol vekselvirkninger - interaktion reducerer energien i molekylet)
Større Stokes skifte = mere polære omgivelser

Question 17

Tryptofan er vigtig som.. fordi ..

Answer 17

Indikator for det omgivende miljø
Fordi Excitation af tryptofan fører til en stor stigning af dipolmomenten (x4) – derfor mere interaktion med miljøet (flere dipol-dipol vekselvirkninger ved polært miljø)

Question 18

Rødskifte

Answer 18

Skifte mod længere bølgelængde (rødt spektrum) for emission
Tab af energi
Polær solvent

Question 19

Blåskifte

Answer 19

Skifte mod kortere bølgelængde (blåt spektrum) for emission
Højere energi
Hydrofobt miljø

Question 20

FRET

Answer 20

Flourescens Resonoans Energy Transfer
Kræver overlap af emissionsspektrum (don) og absorptionsspektrum (acc)
og en førsteafstand (under 5 Å)
To flouroforer internt i molekyler (Tyr og Trp spektre overlapper også) eller i forsk molekyler –
Kan sige noget om interaktion og intern dynamik

Question 21

Quenching

Answer 21

Dæmpning af bølgens intensitet

Alle polære grupper (inkl disulfider) quencher Trp’s fluorescens

Question 22

CD spektroskopi

Answer 22

Cirkulær dikroisme
Måler forskel i absorption ml højre- og venstredrejet lys
Chirale C og aromatiske sidekæder i asymmetriske miljøer er optisk aktive og skaber derfor skaber denne forskel
Siger derfor noget om backbone (sekundær struktur)

Question 23

CD spektre

Answer 23

Unikke for sekundærstrukturer og for hvert protein

Question 24

Alpha helix CD spektrum (min og maks)

Answer 24

Min:
222 og 208 nm
Maks:
192

Question 25

Beta helix CD spektrum (min og maks)

Answer 25

Min:
216 nm
Maks:
195 nm

Question 26

Random coil CD spektrum (min og maks)

Answer 26

Min:
200 nm
Maks:
212 nm

Question 27

3 metoder til struktur bestemmelse

Answer 27

CryoEM (elektronmikroskopi)
NMR (Nucleat Magnetic Resonance)
X-ray krystallografi

Question 28

Fordele og ulemper ved cryoEM

Answer 28

+
Kan se store proteiner, intet behov for krystaller?
-
Lav resolution