F3 Heterolog ekspression og posttranslationelle modifikationer Flashcards
Tjek op på flere PTM's?
Homologe protein ⇔
De har samme oprindelse
Det kan de være på to måder (ortologer og paraloger)
Ortologer
Homologer i forskellige arter (afledt fra samme stamprotein)
Paraloger
Homologer i samme art (afledt ved genduplikation)
Heterolog ekspression
Ekspression af proteiner i en fremmed vært
Rekombinant plasmid elementer
Promotor, ribosombindingssted, selektionsmarkør (typisk resistensgen), gen (evt. med tag)
Tags (definition)
Proteinsekvenser til mærkning af protein (identifikation og oprensning)
Tags
Proteintags (GFP og Glutathion S-transferase) – hhv. identifikation og cellulær lokalisering + detektion og affinitetsoprensning His_6 tag (6xHistidin) – affinitetsoprensing Peptidtags (FLAG tag, Myc tag og HA- tag) – genkendes af antistoffer
3 slags metoder der benytter antistoffer
Immunoprecipitation (protein udfældning via antistoffer)
Affinitets kromatografi
Immunoblots/Western blots
Immunoblots/Western blots
Gelelektroforese på SDS-PAGE separerer proteiner efter ladning og størrelse.
Proteiner overføres fra gel til hydrofobt filter ved at lade en strøm løbe over. Neg til pos – blottes/blotting
Tilsætning af antistof for interessante protein, vask, tilsætning af anti-antistof med label (fx enzymatisk aktivitet)
Fordele og ulemper ved heterolog ekspression
Fordele:
Biligt, hurtig vækst
Ulemper:
Ikke sikkert proteinet folder korrekt (kan mangle korrekte PTM’s)
Posttranslationelle modifikationer (PTM’s)
Kovalente ændringer i proteiners struktur efter translation
Sekretoriske system i eukaryoter
Endoplasmisk retikulum – Golgi (fra cis til trans)
– Endosomer/lysosomer eller
– Transportvesikler – ECM
Protein translokation
Risosom + mRNA = translation
Translation laver signal sekvens
Signalsekvens + SRP = translationsstop
SRP + SRP receptor, ribosom + ribosom receptor = translationsstart
SRP dissocierer
Signalpeptidase i ER lumen kløver signalsekvens
Signalpeptider
Dirigerer proteiner til ER N-terminale sekvenser 17-25 AA Hydrofobisk alfahelix rig i A og L Sluttes med AGS x AGS efterfulgt af neu eller neg protein Starter med min 1 K/R
N-glykosylering protein
Oligosaccharyl transferase (OST)
N-glykosylering genkendelsessekvens
Asn – X – Ser/Thr
N-glykosylering
Sekvensen Asn – X – Ser/Thr genkendes af OST der påsætter “core” glykan på Asparagin
“Core” glykan modificeres videre i sekretoriske system
N-glykosylering egenskaber
Hydrofil
Dynamisk og omfangsrig
Vigtig for stabilitet og foldning
Vigtig for lokalisering i cellen
Oxiderende kompartments
ER, Golgi, lysosomer
Vigtig for dannelse af disulfidbroer (hovedsageligt i ER)
Reducerende kompartments
Cytosol
Disulfidbroer reduceres i cytosol
Thioler og disulfid funktioner i celler
Udveksling af redox ækvivalenter
Reduceret protein kan oxideres af disulfid og omvendt
Dithiothreitol (DTT)
Reducerer (i åben ring) og oxiderer (lukket ring) proteiner med cystiner (SS) og cysteiner (HSSH)
PTM’s i ER
Glykosylering og dannelse af disulfidbroer
PTM’s i Golgi
Proteolystisk modificering
prohormon konvertase i sene Golgi
Typer af PTM’s
Phosphorylering, glykosylering, acetylering, methylering, ubiquitinering, sumoylering, S-nitrosylering
Lipidmodifikationer
Proteolytisk modificering
Disulfidbroer
Vigtigt for valg af proteinfabrik
Bakterie/eukaryot?
Cytosolisk/sekretorisk protein?
PTM’s eller cofaktorer?
Interaktionspartnere?
