F3 Heterolog ekspression og posttranslationelle modifikationer

Question 1

Homologe protein ⇔

Answer 1

De har samme oprindelse

Det kan de være på to måder (ortologer og paraloger)

Question 2

Ortologer

Answer 2

Homologer i forskellige arter (afledt fra samme stamprotein)

Question 3

Paraloger

Answer 3

Homologer i samme art (afledt ved genduplikation)

Question 4

Heterolog ekspression

Answer 4

Ekspression af proteiner i en fremmed vært

Question 5

Rekombinant plasmid elementer

Answer 5

Promotor, ribosombindingssted, selektionsmarkør (typisk resistensgen), gen (evt. med tag)

Question 6

Tags (definition)

Answer 6

Proteinsekvenser til mærkning af protein (identifikation og oprensning)

Question 7

Tags

Answer 7

Proteintags (GFP og Glutathion S-transferase) – hhv. identifikation og cellulær lokalisering + detektion og affinitetsoprensning
His_6 tag (6xHistidin) – affinitetsoprensing
Peptidtags (FLAG tag, Myc tag og HA- tag) – genkendes af antistoffer

Question 8

3 slags metoder der benytter antistoffer

Answer 8

Immunoprecipitation (protein udfældning via antistoffer)
Affinitets kromatografi
Immunoblots/Western blots

Question 9

Immunoblots/Western blots

Answer 9

Gelelektroforese på SDS-PAGE separerer proteiner efter ladning og størrelse.
Proteiner overføres fra gel til hydrofobt filter ved at lade en strøm løbe over. Neg til pos – blottes/blotting
Tilsætning af antistof for interessante protein, vask, tilsætning af anti-antistof med label (fx enzymatisk aktivitet)

Question 10

Fordele og ulemper ved heterolog ekspression

Answer 10

Fordele:
Biligt, hurtig vækst
Ulemper:
Ikke sikkert proteinet folder korrekt (kan mangle korrekte PTM’s)

Question 11

Posttranslationelle modifikationer (PTM’s)

Answer 11

Kovalente ændringer i proteiners struktur efter translation

Question 12

Sekretoriske system i eukaryoter

Answer 12

Endoplasmisk retikulum – Golgi (fra cis til trans)
– Endosomer/lysosomer eller
– Transportvesikler – ECM

Question 13

Protein translokation

Answer 13

Risosom + mRNA = translation
Translation laver signal sekvens
Signalsekvens + SRP = translationsstop
SRP + SRP receptor, ribosom + ribosom receptor = translationsstart
SRP dissocierer
Signalpeptidase i ER lumen kløver signalsekvens

Question 14

Signalpeptider

Answer 14

Dirigerer proteiner til ER
N-terminale sekvenser 
17-25 AA
Hydrofobisk alfahelix rig i A og L
Sluttes med AGS x AGS efterfulgt af neu eller neg protein
Starter med min 1 K/R

Question 15

N-glykosylering protein

Answer 15

Oligosaccharyl transferase (OST)

Question 16

N-glykosylering genkendelsessekvens

Answer 16

Asn – X – Ser/Thr

Question 17

N-glykosylering

Answer 17

Sekvensen Asn – X – Ser/Thr genkendes af OST der påsætter “core” glykan på Asparagin
“Core” glykan modificeres videre i sekretoriske system

Question 18

N-glykosylering egenskaber

Answer 18

Hydrofil
Dynamisk og omfangsrig
Vigtig for stabilitet og foldning
Vigtig for lokalisering i cellen

Question 19

Oxiderende kompartments

Answer 19

ER, Golgi, lysosomer

Vigtig for dannelse af disulfidbroer (hovedsageligt i ER)

Question 20

Reducerende kompartments

Answer 20

Cytosol

Disulfidbroer reduceres i cytosol

Question 21

Thioler og disulfid funktioner i celler

Answer 21

Udveksling af redox ækvivalenter

Reduceret protein kan oxideres af disulfid og omvendt

Question 22

Dithiothreitol (DTT)

Answer 22

Reducerer (i åben ring) og oxiderer (lukket ring) proteiner med cystiner (SS) og cysteiner (HSSH)

Question 23

PTM’s i ER

Answer 23

Glykosylering og dannelse af disulfidbroer

Question 24

PTM’s i Golgi

Answer 24

Proteolystisk modificering

prohormon konvertase i sene Golgi

Question 25

Typer af PTM’s

Answer 25

Phosphorylering, glykosylering, acetylering, methylering, ubiquitinering, sumoylering, S-nitrosylering
Lipidmodifikationer
Proteolytisk modificering
Disulfidbroer

Question 26

Vigtigt for valg af proteinfabrik

Answer 26

Bakterie/eukaryot?
Cytosolisk/sekretorisk protein?
PTM’s eller cofaktorer?
Interaktionspartnere?