Extracción de DNA y PCR

Question 1

¿De qué depende el método de extracción de ADN para el análisis de ácidos nucleicos?

Answer 1

• tipo de ácidos nucleicos que se extraerá (ssADN, sdADN, ARN, ARNm, ARNr)
• organismo de origen (procariota, virus, etc)
• fuente del ácido nucleico (sangre, orina, etc)
• técnica a utilizar

Question 2

¿Qué hace el cloruro de amonio?

Answer 2

disuelve/rompe membranas

Question 3

¿Qué hace el SDS?

Answer 3

Rompe membranas

detergente (las que no se rompen con el c. de amonio se rompen con esta)

Question 4

Extracción de ADN por perlas

Answer 4

Se utiliza un papel para filtrar y retener el DNA

• 1era solución → separar DNA de lípidos y proteínas
• 2da solución → contrarrestar la adherencia del DNA y el filtro

Question 5

¿Qué hace el espectrofotómetro?

Answer 5

• lanza onda de luz
• + luz absorbida = + concentracion

RNA y DNA: 260 nm / Proteínas: 280 nm

Question 6

¿Qué es la fluorometria?

Answer 6

• se unen colorantes fluorescentes al ácido nucleico
• + concentración = + emisión fluorescente

Question 7

¿Qué requiere la PCR?

Answer 7

• secuencia de ADN (single stranded o complementary)
• DNA polimerasa (taq)
• desoxirribonucleicos (dNTP)
• primers

Question 8

ADN polimerasa

Answer 8

Polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente

Question 9

Temperatura, origen y requisitos para el correcto funcionamiento de la Taq pol

Answer 9

• 95°
• Bacteria thermus aquaticus

Tiene que tener:

• Amortiguadores → pH de 8.4
• dNTP (síntesis)
• Cloruro de magnesio (cofactor)

Question 10

Iniciadores/primers/cebadores en la PCR

Answer 10

• diseñados en el lab
• proporcionan extremo 3’
• muchas C y G (3 puentes de H)
• reconocen secuencias blanco

continua 5’ 3’ y rezagada 3’ 5’

Question 11

Etapas de la PCR (polymerase chain reaction)

Answer 11

• desnaturalización
  → rompe puentes H+ (95°)
• hibridación/alineamiento
  → primers alineados en 3’ (50°-60°)
• extensión
  → taq polimerasa pone dNTP’s (72°)

Question 12

Temperatura a la que la taq polimerasa hace su función

Answer 12

72°

Question 13

¿Cuántos ciclos tiene la PCR?

Answer 13

≈ 35 ciclos
cada ciclo da 2 ADN (^)

Question 14

Técnica comente utilizada para la extracción de DNA y sus pasos

Answer 14

Fenol-cloroformo
1. Lisis de membrana
2. Extracción de proteínas y lípidos
3. Precipitación DNA
4. Lavado

Question 15

¿Qué hace la PCR?

Answer 15

Amplifica la secuencias mediante el uso de la taq polimerasa → se ve en electroforesis

Se usa cuando la muestra inicial es pequeña