Espectrofotometria Flashcards
¿Que es la espectofometria?
Medida que se basa en la capacidad que tienen las moléculas de absorber o emitir selectivamente ondas electromagnéticas de una longitud de onda específica.
¿Que es la absorbancia?
Medida de la cantidad de luz que es absorbida por la sustancia
¿Que es la trasmitancia?
Medida de la cantidad de luz que atraviesa la sustancia
¿En que espectro de longitud de onda se realiza la mayoria de espectrometrias?
200-800 nm
¿Cuales son las longitudes de onda de la radiacion UV?
200-400
¿Cuales son las longitudes de onda de la luz visible?
400-700 nm
¿Que es un cromoforo?
Son moleculas capaces de absorber la luz debido a que son conjugadas
¿Cual es la relación entre la energia de la luz y la absorbancia?
La energía de la luz UV y visible es capaz
de excitar electrones π y electrones no
enlazantes desde su estado basal a un
nivel energético mayor y en consecuencia la molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente.
¿Las proteinas son cromoforos?
No, pero se utiliza un reactivo, que le entrega color y permite la obtención de la muestra
¿A mayor cantidad de enlaces conjugados, es mayor o menor la capacidad de absorcion?
Mayor
¿Ejemplo de un reactivo cromoforo?
Azul de comassie
¿Que establece la ley de lambert-beer?
Establece que la absorbancia es directamente proporcional al numero de moleculas (aka la concentración) de la solución
¿Por que es mejor trabajar con la absorbancia que con la transmitancia?
Porque la absorbancia tiene una relación lineal con la concentracion
¿Cuales son los componentes de un espectrofotometro?
- Fuente de luz
- Selector de longitud de onda
- Cubeta
- Detector
¿La longitud de onda de trabajo es dependiente o independiente de la concentración de la sustancia?
Independiente
¿Cuales son los pasos para construir una curva de calibración?
- Preparación de diluciones seriadas de una solución stock del compuesto a analizar
- Medir en el espectrofotomero la absorbancia de cada tubo
- Construir la grafica
¿Cual es la ventaja del ensayo con absorción UV?
Pequeño volumen de muestra, rápido
y económico.
¿Cual es la desventaja del ensayo con UV?
Incompatible con detergentes, posee alta variabilidad
¿Cual es la ventaja del ensayo con Acido Bicinconinico?
Compatible con detergentes y
desnaturalizantes, baja variabilidad
¿Cual es la desventaja del ensayo con Acido Bicinconinico?
Compatibilidad con agentes reductores baja o nula.
¿Cual es la ventaja del ensayo con el metodo de Bradford?
Compatible con agentes reductores, rápido
¿Cual es la desventaja del ensayo con el metodo de Bradford?
Incompatible con detergentes
¿Cual es la ventaja del ensayo con Lowry?
Alta sensibilidad y precisión
¿Cual es la desventaja del ensayo con Lowry?
Incompatible con detergentes y agentes
reductores, es un procedimiento largo
¿Para que se utilizan los agentes reductores?
Estabilizar las proteinas en la solución
¿Para que se utiliza detergente en una espectofotrometria?
Solubilizar proteínas de membrana
¿Que materiales de cubeta funcionan para el espectro de luz visible?
- Vidrio borosilicato
- Plastico
¿Que materiales de cubeta funcionan para el espectro ultavioleta?
- Cuarzo
¿Cual es la formula de absortividad?
A = absortividad molar x concentración de la sustancia x ancho de la cubeta
¿De que depende la absortividad molar?
La longitud de onda de la luz, del disolvente y del pH.
¿A que nos referimos cuando hablamos de coeficiente de extinción molar al hablar de concetración?
Cuando la concentración se expresa en moles por litro
¿A que nos referimos cuando hablamos de coeficiente de extinción especifico al hablar de concentración?
Cuando la concentración se expresa en gramos por litro
¿Cual es el limite de detección de la absorción UV?
0,1-100 ug/mL
¿Cual es el limite de detección del acido bicinconinico?
20-2000 ug/mL
¿Cual es el limite de detección de el azul de comassie?
20-2000 ug/mL
¿Cual es el limite de detección del ensayo Lowry?
10-1000 ug/mL
¿A que longitud de onda absorbe la absorción UV?
280 nm
¿A que longitud de onda absorbe el acido bicinconinico?
562 nm
¿A que longitud de onda absorbe el azul de comassie?
595 nm
¿A que longitud de onda absorbe el ensayo de Lowry?
750 nm
¿A que residuos de aminoacido se une principalmente el Azul de Comassie?
- Arginina
- Triptófano
- Tirosina
- Histidina
- Fenilalanina
¿En que longitudes de onda trabaja el cuarzo?
Menor de 350 nm
¿En que longitudes de onda trabaja el Vidrio borosilicato?
380 - 780 nm
¿En que longitudes de onda trabaja el plastico?
400 - 800 nm
¿Cual es la formula de concentracion?
Volumen final stock =
(Concentración inicial stock x volumen utilizado stock)
/ volumen total del tubo
