Enzyme Flashcards
In vielen Enzym-Tests werden nicht die natürlichen Substrate und Produkte eingesetzt. Warum ?
Viele Produkte sind schwer nachzuweisen. Einige lassen sich nur schlecht messen, wohingegen andere schwer von den restlichen Substanzen der Reaktion zu unterscheiden sind. Daher werden gerne Substrate verwendet, die noch vom Enzym umgesetzt werden, jedoch leicht messbare Produkte liefern. Beispielsweise finden häufig Substrate Verwendung, die farbige Produkte liefern, die dann photometrisch detektiert werden können.
Geben Sie ein Beispiel für eine durch eine Hydrolase katalysierte Reaktion !
Hydrolasen katalysieren eine Reaktion, bei der ein Wassermolekül an einer Verbindungsstelle addiert wird, die ursprünglich durch das Entfernen eines Wassermoleküls entstanden ist. Beispiele hierfür sind Ester, Peptidbindungen, glykosidische Bindungen….
Wie werden Substrate im aktiven Zentrum gebunden ?
Das aktive Zentrum ist ein kleiner Teil des Enzyms, bei dem meist ein dreidimensionaler Hohlraum durch Aminosäuren unterschiedlicher Regionen und Polypeptidketten gebildet wurde. Das Substrat wird hier durch zahlreiche nicht-kovalente Wechselwirkungen wie z.B. elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen gebunden. Die Spezifität des Enzyms für ein Substrat hängt dabei von der präzisen Anordnung der funktionellen Gruppen innerhalb der Bindungsstelle ab.
Du denkst, ein Substrat passt in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins Schlüsselloch… Dein Kumpel ist da anderer Meinung, wer hat Recht ?
Beide haben bedingt Recht. Generell passt ein Substrat präzise in die Bindungsstelle wie ein Schlüssel ins Schlüsselloch. Allerdings ist die Bindungsstelle eines Enzyms nicht zwangsweise ein starres Konstrukt, sondern kann durchaus flexibel sein. So kann ein Substrat auch die Form der Bindungsstelle ein bisschen anpassen, eine Hypothese die als „Induced Fit“ bekannt ist.
Bei einer enzymatischen Reaktion im Reaktionsgefäß kann es zur Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts kommen. Wieso passiert dies nicht in lebenden Organismen?
In der Zelle werden die Reaktionsprodukte in Folgereaktionen umgesetzt, daher erreicht die Reaktion hier kein Gleichgewicht.
Beschreibe die Michaelis-Menten Gleichung ! Definiere alle Parameter !
V0 = Vmax(S/(S + KM)) Anfangsgeschwindigkeit: V0 Maximalgeschwindigkeit: Vmax Substratkonzentration: S Michaelis Konstante: KM
Was bedeutet Vmax ?
Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit oder Rate der Reaktion bei einer gewissen Enzymmenge, gesättigt mit Substrat.
Was ist die Obergrenze von kcat / KM ?
Die Diffusionskontrollierte Interaktion von Substrat und Enzym bestimmt die Obergrenze der Rate. Diese liegt bei 10^8 – 10^9/sM
Wie unterscheiden sich die Zwischenstufen bei Enzymmechanismen mit mehreren Substraten ?
Bei einem sequentiellen Mechanismus binden beide Substrate und bilden einen ternären Komplex aus. Bei einem Ping-Pong Mechanismus werden ein oder mehrere Produkte freigesetzt bevor alle Substrate gebunden sind. Somit werden hier ausgetauschte Enzymintermediate gebildet.
Nennen Sie ein Beispiel, beidem beide Substrate vor der Katalyse gebunden werden.
Z.B. Laktatdehydrogenase und Kreatinkinase.
Denken Sie dass die Reihenfolge der Substratbindung eine wichtige Rolle für die Enzymkatalyse spielt?
In manchen Fällen, ja. Bei Ping-Pong Mechansimen beispielsweise muss das richtige Substrat binden um das korrekte Enzymintermediat zu bilden. Bei sequentiellen Mechanismen kommen sowohl geordnete Substratbindung (z.B. Laktatdehydrogenase), als auch ungeordnete Substratbindung und Produktfreisetzung vor (Kreatin Kinase).
Wie unterscheiden sich die Typen der Inhibition kinetisch ?
Kompetitive Inhibition kann durch große Mengen an Substrat unwirksam gemacht werden. Jedoch ist der apparente KM – Wert erhöht. Bei der nichtkompetitiven Inhibierung kann Substrat an den EI Komplex binden, jedoch ist Vmax vermindert. Bei der gemischten Inhibierung können beide Werte abweichen.
Was ist ein Affinitätslabel ?
Hierunter versteht man ein Substratanalogon, das strukturell dem Substrat sehr ähnlich ist, an das aktive Zentrum des Enzyms bindet und chemisch mit einem Rest des aktiven Zentrums reagiert. Es wird dazu verwendet, die Enzymstruktur und den Reaktionsmechanismus zu erforschen.
Was sind Übergangszustandsanaloga ?
Diese sehr wirksamen Inhibitoren ahmen die Struktur eines Übergangszustandes im katalytischen Prozess nach. Sie binden sehr fest an das aktive Zentrum und sind nützlich bei der Aufklärung der Enzymstruktur und des Reaktionsmechansimus.
Was ist die Herausforderung für eine Protease bei der Hydrolyse einer Peptidbindung?
Die Carboxylfunktion der Peptidbindung ist nicht sehr reaktiv. Die Protease muss diese Funktion aktivieren um den nukleophilen Angriff von Wasser zu unterstützen
Wie können kovalente Modifikationen genutzt werden um den Mechanismus eines
Enzyms zu untersuchen?
Wenn für eine bestimmte Aminosäure angenommen wird, dass diese am Mechanismus beteiligt ist, führt eine kovalente Modifikation des Restes zu einer Änderung der Enzymaktivität. Jedoch, muss diese Methode gewöhnlich durch andere Techniken bestätigt werden (Bsp. ortsgerichtete Mutagenese, Zirkluardichroismus, …) um auszuschließen, dass der Verlust der Aktivität beispielsweise durch konformationelle Änderungen verursacht wird.
Warum werden Substratanaloge eingesetzt um die Aktivität von Enzymen zu messen?
Ein Enzymaktivitätstest muss so gestaltet sein, dass der Verbrauch des Substrates bzw. die Bildung des Produktes schnell und einfach gemessen werden kann. Substrate die bei der Umsetzung ihre spektralen Eigenschaften ändern, können somit leicht mit Hilfe eines Spektrophotometers quantifiziert werden.
Worin liegt die Ursache für den „burst“ der Aktivität und die folgende steady-state
Reaktion von Chymotrypsin wenn man den Reaktionsverlauf mit Hilfe eines stoppedflow
Spektrophotometer verfolgt?
Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen in einer Zweischrittreaktion. Dabei ist der erste Schritt (Bildung des Acyl-Enzym-Intermediates) schneller ist als der zweite Schritt (Hydrolyse).
Was unterstützt die Theorie, dass die katalytische Triade ein effektives Mittel ist um
die Hydrolyse von Peptide zu bewerkstelligen?
Zahlreiche verschiedene Enzyme unter ihnen die Peptidasen und einige Esterase nutzen ähnliche Reaktionsmechanismen. Während die Strategie dieselbe ist, sind die darin beteiligten Aminosäurereste verschieden. Dies führt zu den Schluss, dass dieser häufig zum Einsatz kommende Mechanismus das Ergebnis von konvergente Evolution ist.
Was ist die allgemeine Strategie von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?
Alle nutzen einen Mechanismus bei dem ein Nukleophil gebildet wird, welches dann die Carbonylfunktion der Peptidbindung angreift.
Was ist das Nukleophil von Cystein-, Metallo- und Aspartatproteasen?
Das Nukleophil ist Wasser.
Medikamentenentwicklung zur Inhibierung von Enzymen ist ein wichtiger Bereich der
pharmazeutischen Forschung. Welche Enzymeigenschaften sind in diesem
Zusammenhang interessant?
Enzyme können durch Wechselwirkungen mit einem potentiellen Wirkstoff, welcher entweder im aktiven Zentrum oder in einer regulatorischen Stelle bindet, inhibiert werden. Die Struktur von natürlichen Substraten und Aktivatoren und deren Bindungsstellen sind nützliche Angriffstelle für die Entwicklung neuer Medikamente. Dabei ist die Bindungsaffinität und Spezifität wichtig. Mit Enzymaktivitätstest kann der Einfluss der Inhibitoren auf kcat-, KM-, und Vmax-Werte bestimmt werden.
Medikamentenentwicklung zur Inhibierung von Enzymen ist ein wichtiger Bereich der
pharmazeutischen Forschung. Welche Enzymeigenschaften sind in diesem
Zusammenhang interessant?
Enzyme können durch Wechselwirkungen mit einem potentiellen Wirkstoff, welcher entweder im aktiven Zentrum oder in einer regulatorischen Stelle bindet, inhibiert werden. Die Struktur von natürlichen Substraten und Aktivatoren und deren Bindungsstellen sind nützliche Angriffstelle für die Entwicklung neuer Medikamente. Dabei ist die Bindungsaffinität und Spezifität wichtig. Mit Enzymaktivitätstest kann der Einfluss der Inhibitoren auf kcat-, KM-, und Vmax-Werte bestimmt werden.
Wie wird in der Gegenwart von Carboanhydrase Bicarbonat gebildet?
Ein Zinkion unterstützt die Bildung eines Hydroxidions, welches Kohlendioxid angreifen kann.
Welches Merkmal von Carboanhydrase erlaubt die schnelle Hydratatisierung von
Kohlendioxid?
Die räumliche Annäherung der beiden Reaktanten (Kohlendioxid und Wasser) und die Gegenwart eines Buffersystems welches die Protonentransferreaktionen unterstützt.
Welchen Mechanismus nutzen Restriktionsendonukleasen um DNA zu spalten?
Ein aktiviertes Wassermolekül greift direkt das Phosphoratom der Phospodiesterbindung an.
Die Sequenz der 6 basenpaarlangen Restriktionsschnittstelle von EcoRV ist GATXXX.
Wie lautet die komplette Sequenz der Erkennungsstelle?
GATATC
CTATAG
Warum sind P-loop Domänen und Mechanismen weit verbreitet?
Diese Strukturen sind in der Lage nach Bindung eines NTP große konformationelle Änderungen durchzuführen und NTP zu hydrolysieren. Diese strukturelle Vielfältigkeit erlaubt eine breite Spezifität.
Warum sind Metallionen für die Aktivität der meisten NTP-abhängigen Enzyme notwendig?
Diese Enzyme binden nicht NTP, sondern den Metallionen-NTP-Komplex.
Was ist die Funktion der Aspartattranscarbamoylase?
Das Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Synthese von Pyrimidinen. Es kondensiert Carbamoylphosphat und Aspartat zu N-Carbamoylaspartat und anorganischem Phosphat zu bilden.
Geben Sie mehrere Beispiele für Enzyme und Proteine, die durch proteolytische
Aktivierung aktiviert werden.
Beispiele sind Verdauungsenzyme (Trypsin), Hormone (Insulin), Gerinnungsenzyme (Fibrinogen), Entwicklungsprozess Proteinen (Kollagen) und Apoptose-Proteine (Caspasen).
Warum war es überraschend, dass CTP ATCase hemmt?
Die Substrate für ATCase sind Carbamoylphosphat und Aspartat. Diese Moleküle ähneln nicht CTP. Somit war es klar, dass CTP nicht an der aktiven Stelle, aber dafür an einer anderen regulatorischen Stelle binden muss.
Folgen allosterische Enzyme der traditionellen Michaelis-Menten-Kinetik? Zeichnen
Sie ein Diagramm der Reaktionsrate relativ zur Substratkonzentration für ATCase und
vergleichen Sie es mit dem Diagramm eines Michaelis-Menten Enzyms.
Nein, ATCase zeigt eine unterschiedliche Kinetik. Eine graphische Darstellung der Geschwindigkeit gegen Substratkonzentration zeigt eine sigmoidale Kurve, entgegengesetzt der einfachen hyperbolischen Kurve eines Enzyms das der Michaelis-Menten-Kinetik folgt.
Wie unterscheidet sich das sequentielle Modell von dem symetrischen Modell für
allosterische Enzyme?
Das symetrische Modell erlaubt nichts anderes als eine “Alles-oder-Nichts”- Form des Proteins (komplett gespannt oder entspannt). Im Gegensatz dazu ermöglicht das sequentielle Modell eine gemischte Art des Proteins, mit einigen gespannten und entspannten Untereinheiten. Die Form ist abhängig von der Ligandenbindung an eine bestimmte Untereinheit.
Warum ist eine kovalente Modifikation im Vergleich zur proteolytische Aktivierung von Vorteil?
Kovalente Modifikation sind in der Regel ein reversibler Prozess.
Phosphorylierung ist ein äußerst wirksames Instrument für die katalytische Steuerung.
Erklären Sie die Gründe.
Eine Phosphorylgruppe fügt negativen Ladungen hinzu, so dass neue elektrostatische Wechselwirkungen und neue Wasserstoff-Bindung entstehen können. Die freiwerdende Energie bei der Phosphorylierung ist groß, wodurch sich das konformelle Gleichgewicht der verschiedenen Zustände beeinflusst werden kann. Die Verwendung von ATP bedeutet, dass die Reaktion mit dem Energie-Status der Zelle verknüpft ist. Phosphorylierung ist schnell, umkehrbar und kann zu verstärkenden Wirkungen führen. Diese Faktoren beeinflussen strukturelle, thermodynamische, regulatorischen und kinetischen Eigenschaften.
Wie wird die Kinase-Kaskade aktiviert?
Der Prozess wird oft durch Hormone, die an Membran-Rezeptoren binden eingeleitet. Dieser Prozess aktiviert die Adenylat Cylase, die die Bildung von cAMP, einem intrazellulären Botenstoff bewirkt. Das cAMP aktiviert eine wichtige Protein-Kinase. In eukaryotischen Zellen ist dies ein allosterisches Enzym, die Protein-Kinase A, die dann verschiedenen Zielproteine phosphoryliert.
Wie wird die Blutgerinnungskaskade initiiert?
Sowohl intrinsische (beschädigte Oberfläche) und extrinsische (Trauma) Auslöser können die Kaskade induzieren. Die ersten Schritte unterscheiden sich hierbei, führen aber letztlich zu einem abschließenden, gemeinsamen Weg, um die Fibringerinnsel zu bilden.
Was ist der letzte Schritt im Blutgerinnungweg?
Im letzten Schritt wird Fibrinogen, welches sechs Ketten aus drei Typen Untereinheiten- enthält, verändert. Thrombin spaltet vier der Ketten, was zur Bildung von Fibrinmonomeren führt. Diese Monomere bilden spontan das Fibrinnetz. Das Gerinnsel wird durch Querverbindungen zwischen den Aminosäuren katalysiert durch Transglutaminase stabilisiert
Was ist die zweifache Wirkung von Thrombin?
Zum einen katalysiert Thrombin die Hydrolyse von Fibrinogen um aktives Fibrin zu bilden. Zum anderen spielt es auch eine Rolle beim Herunterfahren der Kaskade durch Regulation von Protein C, einer Protease, die die Gerinnungsenzyme Va und VIIIa verdaut.
