הכפלת ה-DNA Flashcards
אחד המנגנונים החשובים ביותר בביולוגיה הוא מנגנון השכפול של התא ושל ה-DNA. כאשר בעבר הוצעו 3 גישות עקרוניות למנגנון שכפול זה:
- “הגישה השמרנית” (Conservative)-
טענה כי ה-DNA החדש מסונתז במקביל לגדיל הקיים. - “הגישה הסמי-שמרנית” (Semi-Conservative)-
טענה כי הגדיל הקיים משמש תבנית ליצירת 2 גדילי בת, גישה זו היא שהוכחה כנכונה. - גישת ה- Dispersive-
טענה כי מתבצע עירוב בין המקטעים החדשים והישנים כך ש-2 גדילי הבת מערבים בתוכם חלקים מסוימים של הגדילים הישנים וחלקים חדשים גם כן.
הניסוי של Meselson & Stahl (1958):
ב-1958 פורסם הניסוי הבא, שהוכיח כי הDNA- משתכפל בצורה סמי קונסרבטיבית:
הניסוי נערך על חיידקים אשר הונחו בכלי בעל נוזל חנקן רדיו אקטיבי (איזוטופ 15) כלומר, אטום כבד יותר כי יש לו עוד פרוטון, למשך כמה דורות גידלו את החיידקים בתמיסה (שרשרת הDNA אופיינה ככבדה יותר).
העבירו את החיידקים הנ”ל לתמיסת חנקן 14, לא רדיו אקטיבי בכלל. בתמיסה זו, הם עברו הכפלות ונוצר DNA חדש.
פוצצו את החיידקים, ובודדו את הDNA, שמו אותו במבחנה אשר הכילה גרדיינט של סוכרוז, תמיסה, המאופיינת בכך, שכאשר שמים בה חומר כבד – הוא שוקע. כלומר חומצות הגרעין הכבדות בDNA ירדו מטה, ואילו הקלות יותר יצופו מעלה (סיבוב במכונת צנטרפוגה).
תוצאות:
לאחר ההכפלה הראשונה, כלומר בדור הראשון הם קיבלו פס אחד הממוקם במרכז המבחנה.
לעומת זאת בהכפלה השנייה, כלומר בדור השני הם קיבלו שני פסים. האחד בעל מולקולות כבדות הממוקם במרכז המבחנה, ואילו השני בעל מולקולות קלות לחלוטין אשר צף למעלה.
ניתן לראות כי בדור הראשון הDNA מורכב מסליל אחד ישן ואחד חדש לחלוטין בגלל שמיקומו היה במרכז המבחנה.
בנוסף ניתן לראות כי בהכפלה השנייה כבר יש שני פסים, למעלה ולמטה. הDNA העליון מורכב כולו ממולקולות חדשות קלות, ואילו הפס התחתון מורכב מסליל ישן כבד וסליל חדש לחלוטין.
מנגנון ההכפלה
את מנגנון ההכפלה ניתן לחלק לשלושה שלבים, המבוקרים כל אחד בצורה אחרת:
1) Initiation – אתחול – תהליך שגורם לתחילת התהליך של שכפול.
2) Elongation – הארכה – הארכת שרשרת ה-DNA.
3) Termination – סיום התהליך.
חשוב לזכור
חשוב לזכור! כאשר התא מכפיל את עצמו קיימים מספר שלבים. השכפול מתבצע בשלב ה- S. לעומת זאת שעתוק ותרגום מתבצעים בלי קשר להכפלת התא, במהלך כל חיי התא לצורך יצירת חלבונים הכרחיים לתפקוד התא.
הכפלת ה-DNA ביצורים פרוקריוטים:
מודל הכפלה בחיידקים וביצורים פרוקריוטים נקרא בשם Theta Structure (מבנה ɵ). כאשר בתחילה נוצרת “בועה” של DNA מוכפל המתרחבת עד שמסיימת להקיף את כל המולקולה המקורית.
כמובן שההכפלה אינה מתחילה ממקום אקראי, אלא, ממקום מאוד מסוים על הכרומוזום, אשר נקרא Origins Of Replication (ORI). זהו אזור אשר רווי בבסיסי אדנין (A) וטימין (T), מהסיבה הפשוטה שבניהם ישנם רק שני קשרי מימן ולכן מבחינת אנרגטית הם יותר קלים להפרדה. את ההפרדה בין שני הגדילים מבצע האנזים Helicase. חשוב להבין כי מכיוון שהכרומוזום החיידקי הוא למעשה מעגלי, לכן יהיה קיים לרוב רק ORI אחד ויחיד.
לאחר שהאנזים Helicase פרם את אזור ה-ORI, מגיע אנזים נוסף, והוא DNA Polymerase, שתפקידו הוא לסנתז ולבנות את הגדיל החדש על הגדיל הישן. ושמו של הגדיל הישן, הקיים הוא - Template.
הכפלת ה-DNA ביצורים איוקריוטים:
ביצורים איוקריוטים מבנה ה-DNA והכרומוזומים הוא לינארי, הוא לא מעגלי, אבל חשוב להבין כי מנגנון השכפול הוא אותו מנגנון. גם כאן קיים אנזים ה- Helicaseאשר מפריד בין הגדילים באזור ה- ORI והאנזים שאחראי על הסנתוז של הגדיל המשלים הוא DNA Polymerase.
השוואה בין הכפלה בפרוקריוטים ואיוקריוטיים
חשוב להבין כי למרות השוני הגדול בגודל ה-DNA האיוקריוטי שגדול פי 1000 ואף יותר מ-DNA הפרוקריוטי, זמן ההכפלה כמעט זהה, רק פי 20 יותר איטי. והסיבה לכך היא שב-DNA האיוקריוטי קיימים יותר מ-ORI אחד, ולכן ההכפלה מתרחשת במקביל מכמה אזורים שונים.
DNA Polymerase:
למעשה קיימים 3 סוגי DNA Polymerase, I, II, III. אך למעשה האנזים המרכזי שעוסק בפעולת הסנתוז הוא DNA Polymerase III. האנזים גורם להתקפה נוקלאופילית בין קבוצת הפוספאט של נוקליאוטיד קיים לחמצן שעל גבי נוקליאוטיד אחר, כך שנוצר קשר פוספודיאסטרי ומשתחררים שתי מולקולות פוספאט ומולקולת מים אחת.
בניית ה-DNA:
הכיווניות של ה-DNA היא מ-‘5 ל-‘3. כלומר מפחמן מספר 5, המחובר לפוספט, לפחמן מספר 3, המחובר להידרוקסיל (OH). כזכור, מבנה ה-DNA הוא אינו סימטרי, ולכן הגדיל המזווג יהיה באוריינטציה הפוכה לגדיל הראשון. את שני הגדילים מחזיקים ביחד קשרי המימן, הנוצרים בין הבסיסים החנקניים, וההתאמה היא בין A-T (שני קשרים), ו- G-C (שלושה קשרים).
שני גדילי ה-DNA, הם מאקר-מולקולות ארוכות מאוד, והסיכוי ששתי מולקולות כאלה יפגשו ויצרו בהתאמה, את סליל ההליקס, הוא קטן מאוד ואפילו בלתי אפשרי. הדרך היחידה ליצור שני גדילים קומפלמנטרים, היא לבנות ולסנתז אותם ככה מראש.
DNA Polymerase
הסינתוז עובד בדרך כזו בה ישנו גדיל אחד מוכן והשני נבנה עליו בהתאמה. הרכבת המונומריים המשלימים על הגדיל נעשית כמובן ע”י אנזים, הנקרא DNA Polymerase. בשביל ש -DNA Polymerase יתחיל את עבודתו בסינתוז הגדיל המשלים הוא זקוק ל-3 דברים:
1. Template – זוהי התבנית עליו יעבוד האנזים, כלומר, רצף ה-DNA הראשון.
2. dNTPs – אלו הם אבני הבניין החופשיים, הנוקלאוטידים.
3. Primer – ה- DNA Polymeraseאינו יודע מהיכן להתחיל את הסנתוז, הוא חייב שיהיה איזשהו רצף של DNA התחלתי, והוא ה-Primer.
תהליך הסנתוז
לאחר שה-DNA Polymerase קיבל את שלושת תנאי ההתחלה להם הוא זקוק, הוא יכול להתחיל בסנתוז. כאמור, הוא מתחיל את הסנתוז מיד לאחר סיומו של רצף ה-Primer, הוא קולט את הנוקלאוטידים מהסביבה ומחבר אותם אל גדיל ה-Template. דבר ראשון, עוד לפני פעולתו של ה- DNA Polymerase היא ווידוא התאמתו של הנוקלאוטיד החדש לנוקלאוטיד הקיים, ע”י קשרי המימן, אם הנוקלאוטיד אינו מתאים, הוא לא יתייצב, ישתחרר ובמקומו יגיע נוקלאוטיד אחר. כאשר ישנה התאמה בין הנוקלאוטידים ע”י קשרי המימן הוא יתייצב וה- DNA Polymerase יתחיל את עבודתו. הוא יפרק שנים מתוך שלושת הפוספטים וישתמש באנרגיה המשתחררת, ליצירת קשר קוולנטי בינו לבין הנוקלאוטיד הקודם על הגדיל החדש. ביצירת הסליל, ההידרוקסיל (OH), היושב על פחמן מספר שלוש, הוא התוקף את החמצן של קבוצת הפוספט ויוצר את הקשר הקוולנטי. בתגובה זו משתחררים מים ושני הפוספטים הקרויים פירו-פוספט. לאחר חיבור הנוקלאוטיד, DNA Polymerase ממשיך לנוע על הגדיל מכיוון 5 ל-3 וממשיך בבניית גדיל ה-DNA החדש. בסיום התהליך נוצר גדיל קומפלמנטרי, הופכי ומשלים ל-Template.
כזכור, בסוף התהליך מתקבלת מאקרו-מולקולה דו-גדילית המלופפת על עצמה בצורת הליקס. מבנה זה נוצר בזכות קשרי המימן, היוצרים מאין עיוותים בסליל, עד שלבסוף המבנה התוצרי הוא סלילי. מבנה הסליל הוא מאוד מדויק ואינו משתנה לעולם.
Origin of Replication (ORI):
זהו בעצם אזור מסויים על ה-DNA הרווי בבסיסים מסוג A-T, בסיסים אלו נקשרים ע”י שני קשרי מימן, ולכן זהו אזור יחסית שיותר קל לפרימה. אל אזור זה מגיעים אנזימים מסוג Pre_replication Complex. בתחילה אנזימים אלה מביאים את ה-Helicase, שהוא בעצם מבצע את תהליך הפרימה של ה-DNA הדו גדילי, לאחר מכן הם מביאים חלבונים נוספים המונעים משני הגדילים להתחבר חזרה, הם שומרים עליהם מופרדים. לבסוף הם מביאים את DNA Polymerase. כזכור, לפני שה-DNA Polymerase יכול להתחיל לסנתז הוא צריך פריימר, ולא רק אחד, אלא שניים, אחד לכל כיוון על כל גדיל. ה-Primase, זהו אנזים המצוי בתא והוא המביא את הפריימר, זהו בעצם RNA Primer, והוא מהווה את הרצף ההתחלתי. לאחר שהכול מוכן ה- DNA Polymeraseמתחיל את עבודתו ומשכפל את הגדילים מקצה 5 לקצה 3.
בעיות שנוצרות
הבעיה שנוצרת היא הסנתוז בכיוון השני הרי שה- DNA Polymerase לא יכול לעבוד בכיוון ההפוך. הפתרון הוא השימוש ב-Primase. הוא יניח פריימר בנקודה רחוקה יותר ומשם יתבצע השכפול, ככל שהסלילים יפתחו הוא ימשיך ככה ויצור מקטעים רבים המורכבים מרצפי DNA ורצפי פריימר שהוא RNA. למקטעים אלה קוראים מקטעי Okazaki, הם אינם רציפים ומכילים המון טעויות. את הטעויות מתקן האנזים RNase, זהו אנזים שיודע לפרק ולעכל RNA, הוא בעצם מגיע אל כל פריימר ופשוט מוריד אותו. כעת מגיע שוב ה-DNA Polymerase ומשלים את המקטעים החסרים. הבעיה החדשה היא שמקטעים אלו אינם מחוברים קוולנטית אל השרשרת, אין להם את הקשר הפוספו-די-אסטרי. לכן מגיע אנזים חדש, והוא ה-Ligase ותפקידו לחבר את כל הקטעים החדשים קוולנטית בקשר פוספו-די-אסטרי.
טופואיזומראז
אנזים נוסף בעל תפקיד בשעת השכפול הוא ה-Topoisomerase, המשחרר את המתח הנוצר כתוצאה מפתיחת הסליל ע”י חיתוך ואיחוי מחדש של קטעים בגדיל הנפרם.
Important enzymes
1) Helicase אחראי על פתיחת הסליל הכפול וההפרדה בין הגדילים ליצירת מזלג השכפול. דורש פירוק ATP כמקור אנרגיה לפעילותו.
2) Primase מייצר פריימר של RNA על בסיס תבנית ה-DNA שיאפשר את הארכת הגדיל החדש ע”י DNA Polymerase.
3) Single strand DNA binding proteins (SSB) אלו הם חלבונים הנקשרים לגדילים המופרדים על מנת למנוע צימוד מחודש שלהם ולאפשר קישור של הנוקלאוטידים החדשים.
4) DNA Polymerase III מאריך את הגדילים החדשים בכיוון ‘5 –>’3.
ה- Leading strand מתארך ברצף אחיד.
ה- Lagging strand מתארך ברצף ע”י יצירת מקטעי Okazaki.
5) DNA Polymerase I מסיר את פריימר ה-RNA ומשלים את הרצף בעזרת dNTPs
6) ligase אחראי על יצירת הקשר הפוספו-די-אסטרי בין קצה הידרוקסיל ‘3 לבין קצה ‘5 מזורחן של מקטעי אוקזאקי.
משלים את פעולתו של DNA Polymerase I.
7) Topoisomerase
משחרר את המתח שנוצר בסליל ה-DNA במהלך פעילות ה- Helicase ע”י חיתוך הסליל הכפול וחיבורו מחדש.
