שיטות אנליזה Flashcards
ארבעת עקרונות האנליזה:
- גודל (size): ניתן להשתמש בהבדלי הגודל של המולקולות. כל מולקולה היא בעלת גודל שונה, ולכן, אם ישנה אינפורמציה מוקדמת על גודל החלבון או המולקולה שאותה נרצה לנקות, נוכל להשתמש בהבדלי הגודל לטובת הניקיון.
- מטען (charge): עקרון נוסף הוא שמולקולות שונות או חלבונים, הם בעלי מטען חשמלי שונה, ולכן ניתן לנצל עובדה זו כדי לנקות ולהיפטר מהמולקולות שאינן רצויות.
- מסיסות (solubility): עקרון שלישי הוא המסיסות. לכל מולקולה רמת מסיסות שונה, ישנם שמסיסים בתמיסה הידרופילית ואחרים שמסיסים בתמיסה הידרופובית, לכן גם זוהי דרך להפריד בין המולקולות השונות.
- זיקה (affinity): זוהי השיטה המועדפת ביותר, היא הכי טובה.
כרומטוגרפיית זיקה:
לדוגמא, נניח שנרצה לבודד מתערובת שמכילה מאה אלף חלבונים, חלבון אחד בודד.
כזכור מהרצאה קודמת ישנם צמדים ספציפיים היודעים להיקשר אחד לשני באופן ספציפי, אחד הצמדים הוא נוגדן-אנטיגן. לכן ניתן להשתמש בנוגדן כנגד אותו החלבון שאותו אנו רוצים לנקות.
הנוגדן הוא כשלעצמו חלבון המורכב מ-4 שרשראות פוליפפטידיות, והוא בעל צורת Y. שתי הזרועות אלו הם האזורים המסוגלים לקשור את האנטיגן, או במקרה שלנו את החלבון הרצוי.
כאשר ניקח קולונה (צינור זכוכית בעל פתח צר בקצה), ונמלא אותה בגרגירים אינרטיים (כלומר אדישים מבחינה כימית), ובתהליך מאוד מסוים נוכל לקשור את מולקולות הנוגדן על הגרגירים, כך שהם יצפו אותם. כעת ניתן לקחת את תערובת החלבונים (המצויה בבופר) ולהעביר אותה דרך הקולונה. מתוך כלל התערובת החלבונים שאינם מזוהים ע”י הנוגדן ישטפו החוצה, והחלבון הרצוי יישאר קשור לנוגדן בתוך הקולונה.
האינטראקציה שבין הנוגדן לאנטיגן (לחלבון) היא תלוית מטענים, כלומר זהו אינו קשר קוולנטי, לכן כעת כאשר נעביר בקולונה ריכוז מלח גבוה או תמיסת בופר בעלת pH שונה, אז תהייה תחרות בין המלח לאנטיגן או שהמטענים ישתנו בעקבות שינוי ה-pH, וכך החלבון הספציפי, ישתחרר מהנוגדן, ולמעשה נקבל את החלבון הבודד אותו נדרשנו לנקות.
למעשה בשלב אחד ניתן להפריד בין החלבון או המולקולה הרצויה לבין שאר התמיסה, וכל זה בזכות הזיקה, האפיניות, שיש בין הנוגדן לאנטיגן.
יתרונות וחסרונות של כרומטוגרפיית זיקה
. נציין חסרונות:
1) לפעמים אני יודע בדיוק איזה חלבון אני מחפש, אבל אין לי מולקולה קושרת, הנוגדן הספציפי. יכול להיות שאף אחד עדיין לא פיתח נוגדן מסוג זה, יכול להיות שהנוגדן קיים אך הוא מאוד יקר, ולכן לא יהיה ניתן להשתמש בשיטה זו ונעדיף שיטה אחרת.
2) לפעמים אני לא יודע איזה חלבון אני מחפש. בהחלט יכול להיות שאני יודע איזה פעילות הוא עושה ומה תפקידו, אך אני לא יודע איזה חלבון ספציפי הוא. ואם אני לא יודע איזה חלבון זה, אז אני גם לא יודע באיזה נוגדן להשתמש.
דיאליזה
זוהי השיטה הפשוטה ביותר והזולה ביותר.
בשיטה זו ניקח מאין שקית דיאליזה מיוחדת, מאין שקית ניילון, שהיא בעלת חורים קטנים מאוד, גודל החורים הוא עפ”י הזמנה, כל חוקר יכול לבחור לעצמו את גודל החורים שהוא צריך. את השקית מניחים בתוך כלי בתוך תמיסת בופר וכך אם למשל גודל החורים (mwco) שלי הם 70 קילו דלתון, כל מולקולה שקטנה מהגודל הזה, מבחינתה היא לא מרגישה את השקית, והיא בעלת היכולת להיכנס ולצאת ממנה באופן חופשי. לכן המולקולות הקטנות תצאנה החוצה מהשקית בדיפוזיה, עד למצב של השוואת ריכוזים.
במצב הזה המולקולות הגדולות, הכלואות בפנים נקיות יותר, אך לא לחלוטין, לכן ניתן לחזור על התהליך מספר פעמים בבופרים שונים, או לחלופין להגדיל את גודל הכלי, וכך גם להגדיל את רמת הניקיון.
בעזרת שיטה פשוטה וזולה זו ניתן להגיע לרמת ניקיון לא רעה בכלל.
ניתן לשפר את השיטה, ולקחת שקית אחת בעלת חורים בגודל 80 קילו דלתון, ואותה להכניס לתוך שקית נוספת בעלת חורים בגודל של 60 קילו דלתון, ואת שניהם להכניס לתוך תמיסת הבופר. במצב כזה כל המולקולות שקטנות מ-60 קילו דלתון יצאו החוצה, ואילו המולקולות שגדולות מ-80 קילו דלתון יישארו כלואות בשקית הפנימית, וכך נקבל שבתחום הביניים נקבל מולקולות בגודל שבין 60-80 קילו דלתון.
בדרך זו כבר שיפרנו משמעותית את רמת הניקיון של החלבון הרצוי.
חסרונות דיאליזה
המגבלה הגדולה של שיטה זו היא שרמת הניקיון אומנם משתפרת אך היא לעולם לא תהייה 100%. תמיד נשאר עם תערובת שמכילה יותר מחלבון אחד ואפילו יותר מ-100 חלבונים. המגבלה הנוספת היא ששיטה זו יכולה לקחת הרבה מאוד זמן ואפילו מספר שעות.
כדי להגיע לרמת ניקיון טובה יותר מדיאליזה נשתמש באחת מהשיטות הבאות:
Ultra filtration:
כדי לשפר לפחות את נושא הזמן ניתן להשתמש בשיטה זו, העיקרון הוא בדיוק אותו עיקרון. לוקחים קולונה ובתחתית לפני הפיה שמים איזושהי רשת, לדוגמה מנחושת, ועליה שמים ממברנה שמתפקדת כמו שקית הדיאליזה. לתוך הקולונה שופכים את התמיסה, ומכניסים אותה לתוך צנטריפוגה, שיוצרת כוח צנטריפוגלי חזק מאוד וגורמת למולקולות הקטנות יותר לעבור מבין ה-mwco מהר יותר, ולהישטף החוצה. כל המולקולות הגדולות מה-mwco תשארנה כלואות מעל הממברנה. תהליך זה מקצר את הזמן לדקות ספורות.
דוגמא טובה לכך היא חולי דיאליזה, בעלי בעיה בכליות, אשר עוברים תהליך מאוד זהה למה שנזכר למעלה. הדם של החולה מוזרם החוצה, דרך מכונת הדיאליזה ושם הוא עובר סינון מהמולקולות הקטנות, ובעיקר מהאוריאה (שתנן), וכאשר הדם חוזר לגופו הוא נקי ומסונן. הבעיה העיקרית היא שבנוסף לשתנן נשטפים עוד מולקולות קטנות חשובות אחרות, ולכן החולה גם מקבל עירוי במטרה להחזירם אליו.
כדי להגיע לרמת ניקיון טובה יותר מדיאליזה נשתמש באחת מהשיטות הבאות:
gradientSucrose / Density gradient: (מדרג צפיפויות)
דבר ראשון אותו חשוב להבין בהקשר של שיטה זו הוא החוק שאומר כי כל חומר כאשר הוא שוקע, תמיד ייעצר באותה הנקודה שבה הכוח הפועל עליו מלמעלה שווה לכוח הפועל עליו מלמטה.
עפ”י שיטה זו ניקח מבחנה ובה נייצר במעבדה איזשהו גרדיינט של סוכרוז או כל גרדיינט אחר. כלומר נייצר מדרג של ריכוזי סוכרוז כך שלמטה יהיה 60% מעליו 40% מעליו 20% וכו’. כעת בעדינות רבה נוסיף מעל הגרדיינט את תערובת החלבונים בתמיסה המימית. בגלל שהצפיפות של המים קטנה מזו של צפיפות הסוכרוז, הפאזה המימית לא תתערבב עם פאזת הסוכרוז, לפחות לזמן מסוים (בדיוק מאותה הסיבה שפקק שעם צף על המים).
עכשיו את המבחנה נכניס לתוך אולטרה צנטריפוגה. במהירות עצומה זו על המולקולות בתערובת פועל כוח צנטריפוגלי עצום שדוחף את המולקולות פנימה לתוך הגרדיינט. כל מולקולה תידחף לתוך הגרדיינט בדיוק עד לאותה נקודה שבה הכוח הפועל עליה מלמעלה יהיה שווה לכוח הפועל עליה מלמטה. כל זה יקרה כאשר הצפיפות (מסה ליחידת נפח) של המולקולה תהייה שווה לצפיפות הגרדיינט, ומכיוון שהכנסנו מולקולות או חלבונים שונים, הם יעצרו במקומות שונים בגרדיינט, כאשר המולקולה בעלת הצפיפות הכבדה יותר תופיע למטה, ואילו המולקולה בעלת הצפיפות הקטנה יותר תופיע למעלה.
ההפרדה היא לא עפ”י גודל אלא עפ”י צפיפות. וזוהי שיטה מאוד יעילה.
כעת בעזרת מחט שיכנס מלמטה נתחיל לשאוב את התערובת. נשאב כל פעם נפח קבוע, לדוגמה כל פעם 1 mL, ונפזר לתוך 200 מבחנות שונות. המבחנות הראשונות יהיו בעלי החלבונים בעלי הצפיפות הגבוהה יותר, ואילו המבחנות האחרונות יהיו בעלי הצפיפות הנמוכה יותר.
בשלב הבא ניתן לבדוק את המבחנות בעזרת ספקטרו-פוטומטר באורך גל 280 ולראות את כמות החלבונים בכל מבחנה.
ההפרדה בשיטה זו היא טובה מאוד, ניתן לקבל מאלף חלבונים הפרדה של חלבון בודד. ואם נקטין את נפח השאיבה לכל מבחנה אז רמת הניקיון אפילו תעלה עוד יותר.
המגבלה העיקרית בשיטה זו היא האולטרה צנטריפוגה. זה לא מכונה שיש בכל מעבדה, אלא אחת או שתיים למוסד שלם. בנוסף השיטה דורשת עדינות רבה. אך חשוב לזכור כי היא המוצלחת ביותר.
כדי להגיע לרמת ניקיון טובה יותר מדיאליזה נשתמש באחת מהשיטות הבאות:
Gel filtration:
עפ”י שיטה זו נשתמש שוב בקולונה, ולתוכה נוסיף גרגירים אינרטיים מסוג ספדקס. אלו הם גרגירים מיוחדים בעלי תעליות, שקוטרם נקבע עפ”י הזמנה.
מעל הגרגירים נשפוך את תערובת החלבונים, כאשר גודלם משתנה, חלקם גדולים יותר וחלקם קטנים יותר. את התערובת נשטוף בבופר במטרה לדחוף את החלבונים כל הזמן כלפי מטה. במצב הזה המולקולות הגדולות יותר יצאו ראשונות מפתח הקולונה, ואילו המולקולות הקטנות יותר יצאו לאט יותר, הם יתעכבו תוך כדי כניסה ויציאה לתעליות של גרגירי הספדקס.
זוהי שיטה מצוינת להפרדת מולקולות, וכדי לשפר אותה ולאפשר גם הפרדה בהבדלים קטנים מאוד ניתן להאריך את הקולונה עוד יותר. לכן ניתן לראות במעבדות קולונות מאוד ארוכות שמגיעות ל-3 מטר.
דבר נוסף שאפשר לעשות בעזרת שיטה זו הוא להעריך גודל של מולקולה לא ידועה. לדוגמה, אם ניקח 3 מולקולות ידועות, A=100 קילו דלתון, B=50 קילו דלתון, C=25 קילו דלתון ועוד מולקולה לא ידועה. לאחד שנעביר את כל התערובת בקולונה נמצא כי מולקולה A עברה אחרי 10 mL, מולקולה B עברה אחרי 30 mL, ואילו מולקולה C עברה אחרי 50 mL.
כעת נצייר עקומה סטנדרטית כך שציר ה-X אלו הם החלבונים שיצאו, ואילו ציר ה-Y זוהי הכמות במיליליטרים. בעזרת ספקטרו-פוטומטר נוכל לראות היכן החלבון הלא ידוע יצא ובעזרת העקומה נוכל להעריך את גודלו.
כדי להגיע לרמת ניקיון טובה יותר מדיאליזה נשתמש באחת מהשיטות הבאות:
Salting out: (שיטה המבוססת על הבדלי מסיסות).
הכוונה בשיטה זו היא כאילו לגרום לחלבון לצאת מהתמיסה, כלומר לגרום לו לשקוע ע”י המלחה.
הדבר הראשון אותו צריך להבין הוא המסיסות. כאשר אומרים שחומר התמוסס, הכוונה שהוא נפרד למרכיביו השונים, כאשר הם מוקפים בתמיסה, כלומר בממס, והם אינם רואים אחד את השני. לדוגמה, כאשר נמיס מלח בישול NaCl בתוך מים המלח יתפרק ליונים ממנו הוא מורכב, Na+ ו-Cl-, כאשר כל אחד מהם יהיה מוקף במולקולות מים.
כאשר ניקח תערובת חלבונים בתמיסה, ישנם חלבונים יותר הידרופילים וישנם פחות הידרופילים. בתחילה כל מולקולות החלבונים יעטפו במולקולת מים, מכיוון שהם הידרופילים, הם מסיסים. עכשיו נתחיל להכניס מלח אל תוך התמיסה, ובשלב הזה, המים העוטפים את החלבון יעזבו וייפרדו מהם, ויעברו לעטוף את המלח. יוני המלח הם מאוד הידרופילים ולכן הם מושכים את מולקולות המים חזק יותר. מולקולות החלבון כעת יכולות להיפגש ולשקוע.
חשוב להבין כי מולקולות החלבון הן פחות הידרופיליות מיוני המלח, ולכן הם מפסידות לו בתחרות על המים. ככל שהחלבון יותר הידרופילי, הוא יצליח להחזיק יותר זמן בתחרות מול המלח גם בריכוזי מלח גדולים, אך כאשר נוסיף עוד מלח כל החלבונים לבסוף ישקעו.
נקודה נוספת חשובה היא שלא רק ריכוז המלח משפיע על שקיעת החלבונים אלא גם ערכיות המלח. ולכן פותחה הנוסחה המציגה את החוזק היוני: 〖μ 〗_(היוני החוזק)=1⁄2×∑▒〖I^2×[C]〗
כלומר ככל שהחוזק היוני גדול יותר, כך הוא מקטין את המסיסות של החלבונים.
שיטות יעילות יותר מדיאליזה:
Protein solubility Vs. pH and salt concentration:
שיטה זו מבוססת על ה-pH האיזו-אלקטרי של החלבונים. כזכור לכל חומצה אמינית ישנו pH איזו-אלקטרי שונה, כלומר זהו אותו pH בו מקסימום מולקולות נמצאות במצב של צוויטריון. לכן גם לחלבונים כשלעצמם ישנו pH זה, מה שאומר שנטו המטען של החלבון הוא אפס. כאשר חלבון נמצא ב-pH האיזו-אלקטרי, המסיסות של אותו החלבון היא מינימאלית, ולכן חלבונים שונים הם בעלי pH איזו-אלקטרי שונה.
ולכן נניח וניקח תערובת של חלבונים ב-pH מאוד גבוה (12), כל החלבונים יהיו טעונים שלילית. כעת נתחיל להוסיף חומצה ולהוריד את רמת ה-pH לאט לאט. כל פעם שנגיע לאיזשהו pH איזו-אלקטרי של איזשהו חלבון, המסיסות שלו תהייה מינימאלית ולכן הוא ישקע. כעת ניתן להפריד את החלבון השקוע משאר החלבונים, ולאחר מכן להמשיך בתהליך הורדת ה-pH עד לנקודה הבאה.
שיטות יעילות יותר מדיאליזה
אלקטרופורזה (Electrophoresis):
השיטה האחרונה היא שיטת הפרדה על בסיס של הבדל מטענים. המינוח אלקטרופורזה אומר נדידה בשדה חשמלי.
כאשר נשים מולקולת חלבון על פס בתוך שדה חשמלי, החלבונים הטעונים חיובית ינועו לכיוון השלילי, ואילו החלבונים הטעונים שלילית ינועו לכיוון החיובי. זוהי האלקטרופורזה הבסיסית והפשוטה ביותר.
השיטה המתקדמת יותר והנהוגה כיום בכל המעבדות היא SDS-Page. הדבר הראשון אותו אנו צריכים לעשות הוא לבנות מאין פלטה תלת מימדית העשוייה ג’ל Polyacrylamide, הלכודה בין שני זכוכיות. הג’ל הוא למעשה רשת המעכבת את תנועתם של המולקולות הגדולות, בעוד שהמולקולות הקטנות רצות מהר יותר.
חשוב להבין שבשיטה זו אנו משתמשים בחומר SDS, שהוא חומר הטוען את כל החלבונים במטען שלילי, ולכן כל החלבונים שאנו נשתמש בהם יהיו טעונים שלילית. לאחר שנטעין את השדה החשמלי, כל החלבונים ירוצו מהכיוון השלילי אל הכיוון החיובי, או מלמעלה למטה, תוך כדי שהמולקולות הקטנות מגיעות ראשונות ואילו המולקולות הגדולות מתעכבות בדרך בתוך רשת הג’ל.
שיטות הפרדה
גודל:
דיאליזה
אולטרה פילטריישן
גרדיאנט סוכרוז
ג’ל פילטריישן
מטען
מסיסות:
כרומטוגרפיה
Precipitation
אפיניות (כרומטוגרפיית זיקה)
נוגדן-אנטיגן, אנזים-פוספט, רצפטור וליגנד
MWCO Dialysis
קוטר החורים בשקיות
Gel filtration
מולקולות גדולות יותר שלא נכנסות בתעליות יוצאות מהר יותר. בתחרות בין המולקולות הגדולות לבין המולקולות הקטנות שבתעליות תהיה הפרדה טובה יותר ככל שהקולונה ארוכה יותר- “מרחק” שצריכים “לרוץ” בו יותר גדול.
בדיקת גודל של חלבון ע”י הרצת gel filtration של 3 חלבונים ידועים
