Cours 9 Flashcards
quantification de l'expréssion génique
On évalue l’expression d’un gène en mesurant directement _____ (2)
- le niveau d’ARN
- le niveau de protéines
qui suis-je, cette enzyme peut dégrader des substrats synthétiques
beta-galactosidase (dont le gène lacZ code)
utilisations du gène rapporteur
(3)
- déterminer le niveau d’expression
- déterminer la condition favorisant l’expression maximale
- déterminer la localisation
Méthodes d’analyse de l’expression génique en ordre de décroissance pour la quantité de matériel génétique nécessaire
- Northern blot (10 ug)
2.RT - RT-PCR
- qRT-PCR (ng)
4.Biopuce (ug) - RNA-seq (1fg)
Les méthodes de RT, RT-PCR, qRT-PCR dépendent de quoi
- la quantité et qualité de l’ARN
- SANS ADN
- pas d’inhibiteur co-purifié de la RT; sans nucléase
- besoin de la séquence (pour faire amorces)
qui suis-je, analyse transcriptomique qui mesure le niveau de toutes les molécules d’ARN résultat de la transcription
transcriptome
vrai ou faux, contrairement à l’ADN, la composition de l’ARN est variable
vrai, les gènes ne sont pas tous exprimés simultanément et l’expression varie selon les différentes conditions
Avantage et désavantages de la biopuce
Avantage: mesure simultanément l’expression de tous les gènes d’un organisme
Désavantages:
1. dégradation de l’ARN (courte demi-vie)
2.marquage (plusieurs mg de matériel_
3. interprétation
2 types de biopuce
- “microarray” ORF (produit PCR)
- oligonucléotide (amorce)
vrai ou faux, la biopuce est recyclable
vrai
Applications de la biopuce
- comparer l’expression
- déterminer l’Expression
Quel méthode utilisé pour analyser l’expression d’un gène bactérien durant l’infection
qRT-PCR
Quel méthode utilisé pour analyser l’expression de tous les gènes bactériens durant l’infection
transcriptome
Classe d’abondance de l’ARNm
- Forte (240 messages) (95% de la masse d’ARNm)
2.Medium (1300 messages) - faible (700 messages)
Méthodes utilisées lorsque qu’on veut un modèle (pathogène intracellulaire) avec peu de cellules de l’hôte (eucaryote)
- chambre à dialyse
- liquide physiologique (selle ou urine)
Étape infection de macrophages
- ajout de bactéries à des macrophages
2.phagocytose (20min) - lavage
- déterminer le nombre de bactéries après phagocytose (T0)
- ajout du milieu + gentamicine (tue bactéries extracellulaires)
- déterminer le nombre de bactéries après différents temps post-infection
Étapes SCOTS
- Extraction ARN total
- RT de l’ARNm: ARNm bactérien rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) avec séquence terminale défnie
- Hybridation ADNc/ADN génomique: pour augmenter les chances de capturer l’ARNm, l’ADN bactérien biotinylé es pré-hybridé avec de l’ADNr pour bloquer ces sites et ainsi diminuer l’hybridation d’ARNr (85% ARN total)
- Capture sélective: hybrides ADNc-ADNg sont capturés par l’utilisation de billes magnétiques couplées à la streptavidine
- Élution des hybrides
- PCR
- 2 rondes supplémentaires sont réalisées pour aller chercher le transcrit de la classe moyenne et faible.
But SCOTS
Capturer et enrichir les séquences d’ARNm bactériens transcrits, afin d’identifier les gènes exprimés lors d’une infection
Applications SCOTS
- analyser interaction hôte-pathogène
- identifier gènes
3.détecter l’expression de gènes à partir de peu de bactéries
RNA-seq
Séquençage d’ARN à haut débit qui permet de détecter la présence et la quantité de tous les ARN
différence entre RNA-seq et microarray
contrairement au microarray, le RNA-seq n’a pas besoin de connaitre le génome
applications RNA-seq
- SNP (polymorphisme)
- découverte de mutation impliqué dans le cancer (gène différentiellement exprimé)
Nommer 3 gènes rapporteur
LacZ, lux, GFP
étapes vaccin à ARNm
- clonage du gène dans un plasmide
- extraction du plasmide; digestion; purification
- ADN en ARNm : 16 litres; purification
- mélange de l’ARNm avec des lipides; électrochoc d’une nanoseconde= émulsion huileuse (protection de l’ARNm et augmente l’entrée dans les cellules)
- transfère dans une fiole et congélation à -80= vaccin
