cours 10

Question 1

vrai ou faux, les clonages avec bouts francs sont beaucoup plus efficaces

Answer 1

faux, ce sont les clonages avec bouts cohésifs qui sont plus efficaces

Question 2

qui suis-je, utilisation d’une seule enzyme de restriction et l’insert peut se lier dans les 2 orientations possibles

Answer 2

clonages avec bouts cohésifs non directionnels

Question 3

qui suis-je, utilisation de 2 enzymes de restriction différentes pour obtenir la ligation de l’insert dans le sens désiré

Answer 3

clonages avec bouts cohésifs directionnels

Question 4

qui suis-je, transfert de l’insert d’un vecteur à un autre vecteur (couper-coller)

Answer 4

sous-clonages

Question 5

avantage du clonage directionnel

Answer 5

l’obtention de l’insert dans le sens désiré permet l’expression appropriée de la séquence clonée qui est dans la bonne orientation par rapport au promoteur

Question 6

vrai ou faux, les digestions doubles permettent 2 orientations possibles

Answer 6

faux, une seule orientation possible (2 enzymes différentes)

Question 7

digestion d’ADN par deux enzymes de restriction distinctes en une même étape et dans les mêmes conditions réactionnelles

Answer 7

digestions doubles

Question 8

Quelles pourraient être les conséquences de ne pas adapter les conditions de réaction de façon appropriée?

Answer 8

Digestion partielle (une enzyme sera favorisée plus que l’autre (en 2 étapes)) ou activité “étoile”

Question 9

Que faire lorsque les caractéristiques des 2 enzymes sont trop différentes pour permettre une digestion double efficace?

Answer 9

procéder par digestions simples séquentielles. L’ADN cible doit être purifié entre chaque étape de digestion pour établir des conditions de tampon de réaction différentes lors des 2 étapes de digestion

Question 10

Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec deux enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts francs?

Answer 10

Non, les bouts francs ne sont pas spécifiques et donnent 2 orientations possibles

Question 11

Est-ce possible de conceptualiser un clonage directionnel avec 1 enzyme de restriction qui génère des bouts francs et 1 enzyme de restriction qui génère des bouts cohésifs?

Answer 11

Oui, 2 bouts à spécificité différentes

Question 12

Est-ce possible de se retrouver en situation de clonage non directionnel avec des bouts cohésifs provenant de 2 enzymes de restrictions différentes?

Answer 12

non, mais dépend des extrémités

Question 13

Vrai ou faux, des enzymes de restrictions différentes peuvent générer des bouts cohésifs compatibles

Answer 13

vrai, par ex. BamHI et BglII

Question 14

Comment choisir les enzymes de restriction pur un clonage

Answer 14

1. conceptualiser le clonage désiré in silico (clonage directionnel)
2. sélectionner les enzymes appropriées selon la disponibilité des sites de reconnaissance sur le vecteur de clonage
   3.s’assurer que les enzymes sélectionnées ne clivent pas dans l’insert à cloner
3. vérifier que les enzymes sélectionnées peuvent être utilisées en condition de digestion double
4. s’assurer que les bouts cohésifs générés par les 2 enzymes différentes ne sont pas compatibles

Question 15

Que faire dans une situation où une des 2 seules enzymes pouvant être utilisées pour un clonage directionnel a un site de restriction dans l’insert?

Answer 15

1. effectuer une mutagenèse dirigée conservative pour éliminer le site de restriction dans le gène. (changer 1 nucléotide de la séquence) (Avec amorce!)
2. procéder à un clonage non directionnel (utilisation d’une seule enzyme - celle qui ne clive pas dans l’insert)
3. utiliser une autre enzyme produisant des bouts cohésifs compatibles avec l’enzyme ne pouvant être utilisée pour digérer l’insert (attention à la reformation du site suite à la ligation)

Question 16

Comment s’assurer de l’efficacité des digestions?

Answer 16

contrôles de digestions simples avec chaque enzyme sur le vecteur de clonage

Question 17

Comment analyser les résultats des digestions? et pourquoi?

Answer 17

une analyse de taille sur gel parce que l’ADN linéaire migre moins que l’ADN circulaire enroulé

Question 18

quel est l’effet d’une digestion ?

Answer 18

linéarisation

Question 19

étape entre la digestion et la ligation

Answer 19

inactivation ou élimination des enzymes de restriction

Question 20

Comment les enzymes de restriction sont-ils inactivées ou éliminées?

Answer 20

à la chaleur ou purification de l’ADN digéré

Question 21

qui suis-je, enzyme qui lie de façon covalente l’extrémité 5’-P et 3’-OH des séquences d’ADN à proximité.

Answer 21

ADN ligase T4

Question 22

vrai ou faux, l’ADN ligase T4 requiert un apport énergétique fourni par l’hydrolyse de l’ATP

Answer 22

vrai

Question 23

De quelle façon la l’ADN ligase T4 est-elle inactivée

Answer 23

par la chaleur

Question 24

conditions optimales pour la ligase T4

Answer 24

bonne activité à 16 degrés + longue période d’incubation

Question 25

vrai ou faux, la réaction de ligation est plus efficace avec les bouts francs

Answer 25

faux, elle est plus efficace avec les bouts cohésifs simples brins qui forment des pont-H par complémentarité

Question 26

L’efficacité de la ligation des bouts francs dépend de quoi?

Answer 26

L’efficacité est dépendante de la probabilité de contact moléculaire selon le mouvement brownien et la concentration de l’ADN

Question 27

l’étape la moins efficace d’un processus de clonage moléculaire

Answer 27

la ligation

Question 28

Quelle est le meilleur ratio molaire insert:vecteur pour assurer une efficacité maximale

Answer 28

3:1
la réaction contient 3X plus de molécules d’insert que de molécules de vecteur

Question 29

Quel serait l’impact de diminuer le ratio molaire insert:vecteur à 1:1

Answer 29

peut se recirculariser sans avoir un insert

Question 30

Quel serait l’impact de diminuer le ratio molaire insert:vecteur à 9:1

Answer 30

multiples inserts dans clonage, pas le produit désiré, mauvais réarrangement, moins de recircularisation

Question 31

Comment s’assurer de l’efficacité de la ligation?
Comment analyser les résultats?
Quel est l’effet de ce contrôle?

Answer 31

faire un essai de ligation avec un vecteur ayant été linéarisé suite à la digestion par une seule enzyme
circularisation du vecteur,
ce qui entraine la formation de structures enroulées de l’ADN de poids moléculaires plus élevés observables sur gel d’agarose, et qui permet au vecteur d’être maintenu dans les cellules bactériennes après transformation.

Question 32

Comment réduire la probabilité de sélectionner le vecteur parental (non recombinant) avant la transformation?

Answer 32

1. purification du vecteur digéré sur gel pour éliminer les traces de vecteur parental non digéré
2. déphosphorylation du vecteur (jamais sur l’insert) pour éviter que le vecteur parental se reconstitue par ligation (réaction de ligation a besoin extrémité 5’-P)
3. Digestion avec enzyme de restriction dans l’insert parental suite à la ligation pour linéariser les vecteurs parentaux

Question 33

que ne faut-il pas oublier pour vérifier l’efficacité de la digestion simple

Answer 33

le contrôle sans ligation

Question 34

Pourquoi est-il si important de réduire le nombre de molécules du vecteur parental avant la transformation

Answer 34

Parce que le vecteur parental est surenroulé dû à son passage in vivo, et a une efficacité de transformation plus grande que l’ADN non surenroulé comme la construction moléculaire effectuée par ligation in vitro

Question 35

Dans quel cas est-il nécessaire d’inactiver ou éliminer la ligase avant l’étape de transformation?

Answer 35

Lorsqu’il faut effectuer une digestion pour linéariser les vecteurs parentaux

Question 36

Transformation d’ADN

Answer 36

Insertion d’ADN extracellulaire dans une cellule bactérienne

Question 37

compétence bactérienne

Answer 37

capacité d’une cellule bactérienne à recevoir de l’ADN extracellulaire dans son cytoplasme

Question 38

espèce bactérienne naturellement compétente

Answer 38

B. subtilis

Question 39

Comment la compétence et la transformation sont induites?

Answer 39

La compétence par traitement chimique
la transformation par choc thermique ou électrique

Question 40

pourquoi les cellules compétentes doivent être gardées au froid?

Answer 40

pour préserver leur viabilité et leur compétence

Question 41

pourquoi le chlorure de calcium ou de rubidium rend les cellules compétentes?

Answer 41

Ces sels contiennent des cations divalents qui neutralisent les charges négatives des acides téichoiques ou LPS à la surface des bactéries et de l’ADN

Question 42

vrai ou faux, la transformation est un processus où l’ADN est incubé 30min avec les cellules sur glace, suivi d’une incubation 42 degrés pendant 2min, et un retour sur glace 2min. Les cellules sont ensuite incubées dans un milieu riche pour permettre leur récupération et la réplication des plasmides intégrés et l’expression du gène de sélection (résistance à un antibiotique)

Answer 42

vrai

Question 43

vrai ou faux, l’électroporation est plus efficace que le choc thermique

Answer 43

vrai

Question 44

vrai ou faux, l’ADN à électroporer doit être dans l’eau (ne pas contenir de sels)

Answer 44

vrai

Question 45

Pourquoi l’ADN électroporer ne doit pas contenir de sels et comment les cellules deviennent-elles électrocompétentes

Answer 45

avec des lavages multiples au glycérol et des incubations sur glace ce qui stabilise l’enveloppe bactérienne. La présence de sel diminue l’efficacité de la transformation par électroporation et peut même causer des arcs électriques

Question 46

vrai ou faux, l’efficacité de la transformation est bcp plus élevée avec de l’ADN non surenroulé

Answer 46

faux, elle est plus élevée avec de l’ADN surenroulé

Question 47

contrôles pour évaluer l’efficacité d’un clonage

Answer 47

1. cellules compétentes seules (pour vérification des cellules et du milieu sélectif)
2. réaction de ligation avec le vecteur seul (sans insert) pour évaluer le bruit de fond du clonage par le vecteur parental

Question 48

Vrai ou faux, si le nombre de transformants sur les boîtes de clonage est significativement plus élevé que le nombre de transformants sur les boîtes de contrôles avec le vecteur seul, le clonage a bien fonctionné

Answer 48

vrai

Question 49

Lors de la confirmation d’une construction, quel est le contrôle négatif et le controle positif

Answer 49

contrôle négatif: vecteur parental
contrôle positif: source original de l’insert

Question 50

Par quelle méthode la construction est-elle confirmée (2)

Answer 50

par PCR ou par digestion

Question 51

Quels sont les problèmes qui peuvent diminuer les chances de succès d’un clonage moléculaire?

Answer 51

1. mauvaise qualité de l’ADN utilisé
2. faible efficacité de digestion ou activité étoile
3. faible efficacité de ligation
4. faible efficacité de transformation
5. sélection du vecteur parental suite à la transformation

Question 52

chez les eucaryotes, plasmides qui peuvent se reproduire et être sélectionnés dans plus d’un organisme

Answer 52

PLASMIDES NAVETTES