Cours 7

Question 1

Étapes du clonage moléculaire

Answer 1

1. Digestion du fragment d’ADN d’intérêt par enzymes de restriction=insert
2. Digestion du vecteur de clonage par enzymes de restriction
3. Ligation insert+vecteur = construction plasmide recombinant
4. transformation de cellules bactériennes compétentes
5. isolement plasmide recombinant+confirmation construction moléculaire par digestion/PCR et séquençage

Question 2

où se situe le RBS

Answer 2

sur la séquence transcrite (ARNm), dans sa région dite “5’ non codant”, et en amont du codon initiateur ATG

Question 2

Utilités du clonage moléculaire (5)

Answer 2

1. surexpression d’une protéine homologue ou hétérologue
2. expression de gènes à étudier
3. fusions promoteurs pour études de profil transcriptionnel
   4.criblages génétiques
4. séquençage

Question 3

Rôle RBS

Answer 3

il permet la traduction de l’ARNm en protéine et est reconnu par le ribosome

Question 4

Qu’est-ce qui remplace le RBS chez les eucaryotes

Answer 4

la boîte de Kozak

Question 5

Séquence équivalente à un RBS pour surexprimer des protéines en cellules mammifères

Answer 5

IRES (Internal Ribosome Entry Site)
La traduction de ces ARNm viraux est TRÈS efficace

Question 6

Types de sources de l’insert pour le clonage

Answer 6

1. Produit PCR spécifique
2. plasmide recombinant: sous-clonage
3. autre source d’ADN (phage, virus)
4. gène synthétique

Question 7

Qui suis-je, elles coupent à l’intérieur de séquences d’ADN et ne dégradent pas les extrémités

Answer 7

endonucléases

Question 8

En règle général, combien de nucléotides faut-il ajouter en 5’ pour permettre une digestion efficace

Answer 8

6

Question 9

Les amorces sont utiles pour amplifier le gènes à cloner et ajouter des sites de restriction, elles peuvent aussi servir à ajouter d’autres séquences aux produits de PCR qui seront utilisés en tant qu’inserts pour le clonage. donner 3 exemples

Answer 9

1. Un rbs pour la traduction
2. une séquence codant pour un signal de sécrétion
3. une séquence codant pour une fusion traductionnelle

Question 10

Les amorces peuvent également servir à réaliser une mutagénèse dirigée sur un produit PCR ou une construction plasmidique existante dans le but de:

Answer 10

1. corriger une mutation non conservative
2. introduire une mutation non conservative pour inactiver l’activité d’une enzyme (mutant catalytique)
3. introduire une mutation conservative pour éliminer un site de restriction

Question 11

Vrai ou faux, Si la mutation à effectuer est en 5’ ou en 3’ de la séquence amplifiée par PCR, il est possible de l’intégrer avec l’amorce forward ou reverse lors de l’amplification de l’insert

Answer 11

vrai

Question 12

Méthode si la mutation est au milieu du gène

Answer 12

cloner la version sauvage du gène dans un vecteur, puis amplifier tout le plasmide par PCR avec une paire d’amorces qui introduit la mutation. chgmt de nucléotides intégré dans l’amorce “mismatch” qui va propager l’erreur lors de l’amplification par PCR. Le long produit PCR est finalement recircularisé à l’aide d’une enzyme pour reformer plasmide

Question 13

Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage

Answer 13

une molécule d’ADN circulaire extrachromosomique = plasmide

Question 14

Caractéristiques en communs des plasmides classés dans le même groupe d’incompatibilité

Answer 14

Ils ont la même oriC et utilisent la même machinerie moléculaire pour leur réplication

Question 15

Que se passe-t-il lorsque deux plasmides qui font parti du même groupe d’incompatibilité sont dans la même cellule?

Answer 15

Ils ne peuvent pas être maintenus de façon stable dans leur hôte, parce qu’ils sont en compétition pour leurs réplications. Alors ils se divisent à une extrémité chaque pour partitionner

Question 16

2 types de plasmides

Answer 16

1. les plasmides à une seule copie: se répliquent une fois par cycle cellulaire
2. les plasmides multi-copies: peuvent se répliquer n’importe quand, d’où le nombre accru de copies

Question 17

Qui suis-je, ils possèdent des mécanismes moléculaires pour contrôler leurs nombres de copies dans les cellules bactériennes

Answer 17

plasmides

Question 18

Comment les plasmides assurent-ils leur conservation dans les cellules hôtes?

Answer 18

Les plasmides codent pour des systèmes toxines-antitoxine

Question 19

vrai ou faux, la toxine est une molécule antibactérienne instable

Answer 19

faux, elle est stable

Question 20

vrai ou faux, l’antitoxine est une molécule stable qui empêche l’action de la toxine

Answer 20

faux, elle est instable

Question 21

Que se passe-t-il si une cellule fille ne reçoit pas de plasmide

Answer 21

elle va être tuée par la toxine provenant de la cellule mère qui demeure stable, alors que l’antitoxine provenant de la cellule mère est dégradée due à son instabilité

Question 22

Premier plasmide à être utilisé en biologie moléculaire et que permet-il

Answer 22

ColE1 permet de produire la colicine

Question 23

qui suis-je, molécule antibactérienne qui reconnait certaines souches d’E. coli. Elle est impliquée dans la compétition biologique.

Answer 23

colicine

Question 24

qui suis-je, je code également pour une protéine d’immunité qui protège leur hôte contre l’action de la colicine

Answer 24

Le plasmide ColE1

Question 25

Vrai ou faux, ColE1 est un plasmide multi-copies

Answer 25

vrai

Question 26

Que faut-il toujours vérifier dans le vecteur de clonage pour bien planifier nos stratégies de clonage

Answer 26

la présence de RBS
Certains vecteurs de clonage contiennent une séquence RBS de type “consensus” de haute efficacité pour la traduction. D’autres n’en ont pas

Question 27

Qu’est-ce qu’on fait si le vecteur de clonage n’a pas de RBS?

Answer 27

Il faut l’inclure à la construction afin de permettre l’expression protéique

Question 28

2 options pour ajouter RBS

Answer 28

1. Inclure la séquence RBS naturelle du gène à cloner dans le produit PCR
2. ajouter une séquence RBS sur l’amorce forward, en aval du site de restriction et an amont de la séquence d’homologie du gène

Question 29

vrai ou faux, la distance entre le RBS et le codon départ est très importante pour l’efficacité de traduction

Answer 29

vrai

Question 30

vrai ou faux, les vecteurs sont utiles pour le maintien stable des inserts

Answer 30

vrai

Question 31

Les vecteurs sont utiles pour quelles autres raisons?

Answer 31

1. la régulation de l’expression des gènes clonés par l’usage de promoteurs contrôlables par inducteurs (lac)
2. la fusion transcriptionnelle ou traductionnelle

Question 32

Dans quel type de fusion par vecteur modulaire le maintien du cadre de lecture est important?

Answer 32

lors d’une fusion traductionnelle, car elle implique la fusion des cadres de lecture du gène d’intérêt et du gène rapporteur

Question 33

Quelle est la provenance des enzymes de restriction

Answer 33

mécanisme de défense bactérien contre l’infection par des virus à ADN

Question 34

Comment les bactéries font pour éviter que les enzymes de restriction digèrent leur propre ADN?

Answer 34

elles ont des enzymes qui modifient leur ADN en ajoutant des grpmt méthyles aux séquences de reconnaissances des enzymes de restriction. Les enzymes ne peuvent pas couper l’ADN bactérien

Question 35

Action des enzymes de restriction de type I

Answer 35

Elles coupent l’ADN après leurs séquences de reconnaissance. La distance entre les séquences de reconnaissance et les séquences clivées est variable.

Question 36

Quelles sont les 3 sous-unités des enzymes de restriction de type I?

Answer 36

1. se lie à la séquence de reconnaissance
2. méthyle l’ADN reconnu
3. digère l’ADN en aval de l’ADN méthylé

Question 37

Qui suis-je, enzymes de type “suicide” qui sont inactivées après une seule ronde d’activité

Answer 37

enzymes de restriction de type I

Question 38

Action des enzymes de restriction de type II

Answer 38

elles coupent l’ADN dans leurs séquences de reconnaissance.

Question 39

Qui suis-je, enzyme constituée d’une seule unité pour la reconnaissance et le clivage. elle effectue plusieurs rondes d’activités sans être inactivée

Answer 39

enzymes de restriction de type II

Question 40

Quelles sont les deux composantes du système de restriction/modification

Answer 40

une enzyme de restriction de type II et une méthylase. Elles agissent sur la même séquence d’ADN

Question 41

Mécanisme utiliser pour éviter le clivage de l’ADN bactérien

Answer 41

Système de restriction/modification

Question 42

Qu’est-ce que des séquences palindromiques

Answer 42

mêmes séquences dans les deux sens de lecture

Question 43

Les enzymes de restriction peuvent générer des bouts francs ou cohésifs. Lesquelles sont propice au clonage?

Answer 43

les bouts d’ADN cohésifs

Question 44

vrai ou faux, les enzymes de restriction peuvent être inactivées par la chaleur

Answer 44

vrai

Question 45

qu’est-ce qu’une activité étoile

Answer 45

lorsque les conditions de réactions des enzymes ne sont pas optimales et elles perdent leur spécificité et coupent l’ADN dans des séquences autres que leurs séquences de reconnaissance

Question 46

Qui suis-je, version d’enzymes de restriction qui ont moins ou pas d’activité étoile

Answer 46

enzymes de restriction à haute fidélité (HF)