Cours 8 Flashcards
Vrai ou faux, les eucaryotes sont polycystronique
faux, ils sont monocistronique (1 transcrit = 1 gène)
Quelles sont les modifications post-transcriptionnelles du gène eucaryote
- ajout d’une coiffe en 5’
- ajout d’une queue poly-A en 3’
- épissage des introns
Étapes de l’isolation de l’ARN total
- lyse (inhibe l’activité des ribonucléases)
- extraction (chloroforme)
- centrifugation -> enlever phase aqueuse sur le dessus qui contient ARN
- précipitation à l’alcool
5.centrifugation - ajout d’H20
Pourcentage d’ARNm dans l’ARN total
1-5%
Facons d’analyser l’ARN
- électrophorèse
- spectrophotomètre
- fluorescence
- BioAnalyzer (électrophorèse+fluo)
Comment peut-on isoler l’ARNm chez eucaryote
On utilise des Oligo d(T) (queue de polyT): billes magnétiques qui isoles la queue polyA
Étapes de l’hybridation de type Northern
- Extraction ARN
- Électrophorèse (10ug): gel dénaturant (formaldéhyde)
3.transfert sur membrane (simple brin) - hydridation
5.révélation
À quoi sert Northern blot
- Détection: révéler la présence d’ARN spécifiques (taille, abondance) et la localisation
- quantification (mesurer l’expression et déterminer l’abondance)
Étapes protection à la RNase
- hybridation (ARN total+sonde)
- protection: digestion à la RNase (si hybridation =protection)
- électrophorèse et détection (ARN d’intérêt présent si hybridé)
But de la protection à la RNase
Détection d’un ARNm
qui suis-je, enzyme polymérase de l’ADN ARN-dépendante
Reverse transcriptase (RT)
Qui suis-je, à partir de très peu de matériel, on peut faire beaucoup de choses avec cette technique (détection d’un gène et/ou expression absolue ou relative)
RT-PCR
qui suis-je, outil le plus puissant, sensible, et quantitatif pour la détection du niveau d’ARN
q-RT-PCR (qPCR) q=quantitatif
Différence entre RT en 1 ou 2 étapes
1 étape: très spécifique au gène recherché
2. si on veut savoir si plusieurs gènes sont présents
qu’est-ce qu’un sRNA
petit ARN régulateur non codant
les sRNA sont aidés de quelle molécule et quelle est son rôle
aidé par chaperone Hfq qui bloque la traduction
Qu’est-ce que l’ARNi
l’interférence par ARN est un mode de régulation qui dégrade l’ARN double brin lorsque le siRNA (short interfering RNA) se lie au complexe RISC (RNA-induced silencing complex)
Application du RNAi
Utilisation de RNAi pour prévenir l’expression de gènes (ne modifie pas le contenu mais l’expression des gènes)
Qui suis-je, série de séquences répétées intercalées par des séquences uniques (spacer)
CRISPR
Qui suis-je, gènes qui s’associent à CRISPR, peut être des enzymes endo/exo-nucléase, protéines se liant à l’ADN et/ou l’ARN
Cas (CRISPR associated genes)
qui suis-je, jusqu’à 550pb, région AT riche, promoteur, site d’insertion de nouvelles séquences spacer
“leader”
qui suis-je, système qui confère l’immunité contre les infections par les virus
CRISPR-Cas
Mécanisme CRISPR-Cas (5 étapes)
- CRISPR sont transcrits en ARN
- les ARN sont découpés en ARN plus petits, les unités répétés = sites de reconnaissance pour la coupure= crRNA
- certains intervalles (spacer) sont complémentaires d’ADN viraux ou plasmidiques (protospacer)
4.en s’hybridant avec leur cible (ARNg), les crRNA déclenchent la dégradation à l’aide de Cas ou un arrêt de la traduction des ARNm du génome étranger - cette coupure réduit ou annule le pouvoir infectieux des phages ou des plasmides
Séquence de reconnaissance pour Cas9
NGG (PAM)
