Cours 8

Question 1

Vrai ou faux, les eucaryotes sont polycystronique

Answer 1

faux, ils sont monocistronique (1 transcrit = 1 gène)

Question 2

Quelles sont les modifications post-transcriptionnelles du gène eucaryote

Answer 2

1. ajout d’une coiffe en 5’
2. ajout d’une queue poly-A en 3’
3. épissage des introns

Question 3

Étapes de l’isolation de l’ARN total

Answer 3

1. lyse (inhibe l’activité des ribonucléases)
2. extraction (chloroforme)
3. centrifugation -> enlever phase aqueuse sur le dessus qui contient ARN
4. précipitation à l’alcool
   5.centrifugation
5. ajout d’H20

Question 4

Pourcentage d’ARNm dans l’ARN total

Answer 4

1-5%

Question 5

Facons d’analyser l’ARN

Answer 5

1. électrophorèse
2. spectrophotomètre
3. fluorescence
4. BioAnalyzer (électrophorèse+fluo)

Question 6

Comment peut-on isoler l’ARNm chez eucaryote

Answer 6

On utilise des Oligo d(T) (queue de polyT): billes magnétiques qui isoles la queue polyA

Question 7

Étapes de l’hybridation de type Northern

Answer 7

1. Extraction ARN
2. Électrophorèse (10ug): gel dénaturant (formaldéhyde)
   3.transfert sur membrane (simple brin)
3. hydridation
   5.révélation

Question 8

À quoi sert Northern blot

Answer 8

1. Détection: révéler la présence d’ARN spécifiques (taille, abondance) et la localisation
2. quantification (mesurer l’expression et déterminer l’abondance)

Question 9

Étapes protection à la RNase

Answer 9

1. hybridation (ARN total+sonde)
2. protection: digestion à la RNase (si hybridation =protection)
3. électrophorèse et détection (ARN d’intérêt présent si hybridé)

Question 10

But de la protection à la RNase

Answer 10

Détection d’un ARNm

Question 11

qui suis-je, enzyme polymérase de l’ADN ARN-dépendante

Answer 11

Reverse transcriptase (RT)

Question 12

Qui suis-je, à partir de très peu de matériel, on peut faire beaucoup de choses avec cette technique (détection d’un gène et/ou expression absolue ou relative)

Answer 12

RT-PCR

Question 13

qui suis-je, outil le plus puissant, sensible, et quantitatif pour la détection du niveau d’ARN

Answer 13

q-RT-PCR (qPCR) q=quantitatif

Question 13

Différence entre RT en 1 ou 2 étapes

Answer 13

1 étape: très spécifique au gène recherché
2. si on veut savoir si plusieurs gènes sont présents

Question 14

qu’est-ce qu’un sRNA

Answer 14

petit ARN régulateur non codant

Question 15

les sRNA sont aidés de quelle molécule et quelle est son rôle

Answer 15

aidé par chaperone Hfq qui bloque la traduction

Question 16

Qu’est-ce que l’ARNi

Answer 16

l’interférence par ARN est un mode de régulation qui dégrade l’ARN double brin lorsque le siRNA (short interfering RNA) se lie au complexe RISC (RNA-induced silencing complex)

Question 17

Application du RNAi

Answer 17

Utilisation de RNAi pour prévenir l’expression de gènes (ne modifie pas le contenu mais l’expression des gènes)

Question 18

Qui suis-je, série de séquences répétées intercalées par des séquences uniques (spacer)

Answer 18

CRISPR

Question 19

Qui suis-je, gènes qui s’associent à CRISPR, peut être des enzymes endo/exo-nucléase, protéines se liant à l’ADN et/ou l’ARN

Answer 19

Cas (CRISPR associated genes)

Question 20

qui suis-je, jusqu’à 550pb, région AT riche, promoteur, site d’insertion de nouvelles séquences spacer

Answer 20

“leader”

Question 21

qui suis-je, système qui confère l’immunité contre les infections par les virus

Answer 21

CRISPR-Cas

Question 22

Mécanisme CRISPR-Cas (5 étapes)

Answer 22

1. CRISPR sont transcrits en ARN
2. les ARN sont découpés en ARN plus petits, les unités répétés = sites de reconnaissance pour la coupure= crRNA
3. certains intervalles (spacer) sont complémentaires d’ADN viraux ou plasmidiques (protospacer)
   4.en s’hybridant avec leur cible (ARNg), les crRNA déclenchent la dégradation à l’aide de Cas ou un arrêt de la traduction des ARNm du génome étranger
4. cette coupure réduit ou annule le pouvoir infectieux des phages ou des plasmides

Question 23

Séquence de reconnaissance pour Cas9

Answer 23

NGG (PAM)

Question 24

vrai ou faux, chez les bactéries, une coupure double brin est létale

Answer 24

vrai

Question 25

composantes qui permettent l’édition du génome chez les bactéries

Answer 25

Cas9+ ARNg+ recombinase+ ADN recombinant

Question 26

Applications CRISPR-Cas9

Answer 26

1. typages de souche (évolution)
2. vaccination
3. édition du génome

Question 27

Qui suis-je, fusion du tracrRNA et du crRNA qui permet de diriger Cas9 vers une séquence cible spécifique

Answer 27

ARNg

Question 28

qui suis-je , enzyme du système CRISPR qui agit comme des ciseaux moléculaires pour l’ADN à des endroits spécifiques

Answer 28

Cas9

Question 29

dCas9

Answer 29

version modifiée de Cas9 qui ne peut pas couper l’ADN, utilisée pour la régulation de la transcription

Question 30

Processus de réparation après coupure par Cas9 chez eucaryote (2)

Answer 30

1. jonction non-homologue (NHEJ)
2. recombinaison homologue (HDR)