Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

Travaux pratiques 2 > Cours 7 > Flashcards

Cours 7 Flashcards

1
Q

Quels sont les composants d’un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères?

A

Pour tous les clonages

  • Origine de réplication bactérienne = pUC
  • Gène de sélection et maintien dans E.Coli
  • MCS

Spécifique au clonage dans cellules mammifère

  • Promoteur fort (constitutivement actif) = ProCMV
  • Séquence de poly-adénylation
  • Promoteur et Ori eukarote de SV40
  • Gène de sélection conférant résistance de la c eukaryote à antibiotiques
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vrai ou Faux.

Les cellules eukaryotes n’ont pas de site ori comme les bactéries donc l’ADN qui est introduit va se diluer au fil du temps avec la division cellulaire.

A

Vrai

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Pourquoi les cellules COS et HEK 293T sont-elles utilisées pour l’expression protéique?

A

Ces cellules expriment la protéine GrandT (LT) du virus SV40, qui se lie au promoteur SV40 présent dans certains vecteurs et permet leur réplication.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Quel est l’effet de l’amplification du nombre de plasmides dans les cellules COS et HEK 293T?

A

L’amplification du nombre de plasmides entraîne une très forte augmentation de l’expression dans ces cellules.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Quel est le rôle d’un promoteur fort dans les cellules de mammifères ?

A

Un promoteur fort permet une expression élevée du gène d’intérêt dans les cellules de mammifères.

Ex: CMV et TRE

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Pourquoi la séquence de poly-adénylation est-elle importante ?

A

La séquence de poly-adénylation augmente la stabilité des ARNm, ce qui favorise leur traduction.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Quel est l’objectif d’un site de clonage multiple dans un vecteur d’expression ?

A
  • Un site de clonage multiple permet l’insertion de différents gènes d’intérêt dans le vecteur d’expression.
  • il peut aussi servir pour mettre des étiquettes epitope pour la purification/analyse de l’expression
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Pourquoi un gène de sélection est utilisé pour conférer la résistance à un antibiotique dans les cellules eucaryotes ?

A

Pour une transfection stable.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Quels sont les trois types de transfert de vecteurs dans les bactéries ?

A
  • Transformation (perméabilisation de la mem par produits chimiques comme chlorure de calcium ou choc électrique)
  • Transduction (avec virus)
  • Conjugaison (contact directe)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Quels sont les deux types de transfert de vecteurs dans les cellules de mammifères ?

A
  • Transfection (fait avec produits chimiques ou électroporation)
  • Transduction (avec virus)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Explique la transfection transitoire.

A
  • Transitoire prcq dure quelques jours
    → dépend de la stabilité de la protéine exprimée
  • plasmide atteint le noyau et permet l’expression de prot mais devient dilué lors de la mitose ou dégrader.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Explique la transfection stable.

A
  • Intégration d’ADN transfecté dans génome de cellule
  • Évènement rare qui est positivement sélectionné par ajout d’antibiotique de sélection
    → cellules qui n’ont pas intégrées meurent
  • Insertion aléatoire (faible efficacité)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Comment mesure-t-on l’efficacité de la transfection?

A

L’efficacité de la transfection est mesurée par le pourcentage de cellules qui ont absorbé l’ADN.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Quelles sont toutes les méthodes pour l’insertion d’ADN dans une cellule de mammifère? (3)

A
  • Transfection : phosphate de calcium, polycation (PEI), agents cationiques lipidiques
  • Electroporation : nucleofection
  • Virus
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Expliquez la méthode de transfection par phosphate de calcium.

A
  • Formation de précipité : mélange de solution phosphate tamponée + solution de chlorure de calcium contenant de l’ADN
  • Efficace de 50-100% sur certaines lignées
  • Précipité adhère ensuite aux cellules et pénètre par endocytose.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Expliquez la méthode de transfection par utilisation de polycation : polyethyleneimide (PEI).

A
  1. formation d’agrégat condensé soluble d’ADN avec une charge (+) qui s’associe à la membrane cellulaire (-)
  2. Endocytose → Agrégat s’échappe dans le cytoplsame et ADN entre dans noyau
  • ajout d’agent d’hydrophobicité qui augmente l’efficacité de la transfection
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Expliquez la transfection par agents cationiques lipidiques.

A
  1. Lipide (+) encapsule l’ADN → interagit avec membrane cellulaire (-)
  2. Endocytose → réactif lipidique se mélange à l’endosome et ADN libéré entre dans le noyau → transcription en ARN et traduction en prot
  • Endosome peut être transformé en lysosome et ADN sera dégradé
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Expliquez la méthode de transfection par électroporation

A
  • Génération de trous temporaire dans la membrane cellulaire par pulsation électriques.
  • Ces trous permettent à l’ADN de pénétrer la cellule et de se diriger vers le noyau.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Expliquez la nucléofection.

A
  • Introduction de l’ADN directement dans le noyau (et dans le cytoplasme) en utilisant des produits chimique et les pulsations électriques.
  • Efficace même sur des cellules qui ne se divisent pas
  • Expression protéique très rapide
  • Inconvénient: besoin d’équipement spécifique
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Pourquoi est-il important d’optimiser la transfection?

A

L’optimisation de la transfection est importante pour maximiser l’efficacité de l’introduction d’ADN ou d’ARN dans les cellules, ce qui peut améliorer l’expression génique et la production de protéines.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Comment évaluer l’efficacité de transfection en pratique?

A
  • Utilisation d’un marqueur fluorescent sur la protéine d’intérêt.
    → les cellules n’ont pas la même qt d’ADN acquis donc faut choisir les cellules avec signal semblable.
    → avec tags, on peut “choisir” où la protéine va se trouver dans la cellule
22
Q

Donnez des caractéristiques des lentivirus. (4)

A
  • lentivirus: sous ensemble de rétrovirus (génome à ARN)
  • fonctionne dans cellules en division ou pas
  • les virus produits ne s’auto-renouvelle pas
  • mais sur des cellules qui ne sont pas en division, ça prend du temps et besoin de mesure de sécurité en lab.
23
Q

Expliquez les étapes du fonctionnement des lentivirus.

A
  1. transfection de packaging cell (fabriquer des virus avec gènes d’intérêt)
  2. vecteur code pour la prot intérêt + partie suffisante du génome viral pour faire d’autre virus → accumulation des virus dans le packaging cell
  3. infection de cellule d’interet par transduction
    → va verser son génome d’ARN dans la cellule et les outils (RT) nécessaire pour convertir son génome.
  4. intégration de l’ADN dans le génome de la cellules hôte avec séquence de nucléotide qui bordent le gène d’intérêt. cellule hôte possède les infos nécessaire a la prod de la prot.
24
Q

Quels sont les avantages des vecteurs lentiviraux de 3ème génération ?

A

Les vecteurs lentiviraux de 3ème génération offrent une meilleure sécurité, une capacité d’infection de cellules non divisées.

25
Q

Pourquoi les lentivirus ne peuvent pas s’auto-renouveller?

A

Le génome ne code pas pour les autres composants protéiques essentiels (codés par des plasmides distincts)

→ les 3 plasmides auraient besoin de se recombiner et être passés a une nouvelle (rare)

26
Q

Quelle est la différence majeure les vecteurs de 3rd gen et ceux de 2nd gen?

A

Dans le 3rd gen, le packaging plasmid est divisé en deux vecteurs → donc encore moins de chance de se recombiner et se répliquer.

27
Q

Qu’est-ce qu’un baculovirus ?

A
  • Un baculovirus est un virus qui infecte principalement les insectes et est utilisé comme vecteur pour l’expression de protéines recombinantes.
  • Ne se fait pas dans cellules mammifères → pas besoin de précautions spéciales.
28
Q

Expliquez l’exemple de l’Actine dans l’utilisation de baculovirus.

A
  • Gène de l’actine inséré dans le génome du baculovirus est sous le contrôle du promoteur qui opère dans les cellules insectes.
  • Fusionnement au génome les gènes d’une protéine fluorescente rouge
  • Virus avec génome modifié injecte son génome dans la cellules et l’ADN se déplace dans le noyau pour faire la transcription et la traduction de l’actine.
29
Q

Donnez les étapes de préparation de baculovirus. (p26 if its too long to read)

A
  • Insertion du plasmide donneur pFastBac dans une souche spéciale d’E.Coli (pour obtenir un bacmid) → se fait dans dans la “section” lacZ du bacmid
  • Transposition (Tn7 transposase) + Antibiotic selection
  • selection blanc/blue (lacZ) et isolation du bacmid recombinant qui se fait transfecter dans cellules d’insectes avec agents chimique lipidiques
  • obtention de stock de baculovirus → infection + expression ou déterminer le titre viral
30
Q

Qu’est-ce que les systèmes BacMam ?

A
  • Adaptation des baculovirus pour cellules mammifères.
  • Utilisation de promoteurs mammifère et insectes (pCMV)
    → infecte cellules mais pas de réplication
31
Q

Qu’est-ce que le CRISPR-Cas et ses étapes de mode d’action?

A
  • Système immunitaire des bactéries
  • caractérisées par des répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées.
  • Étapes:
    → Acquisition d’ADN étranger
    → Traitement de l’ARN CRISPR
    → RNA-guided targeting of viral elements
32
Q

À quoi sert CRIPSR-Cas9 et ses caractéristiques ?

A
  • édition du génome
  • nucléase d’ADN programmable (enzyme qui peut être conçue pour couper l’ADN à des sites spécifiques)
  • spécificité déterminée par conception d’un ARN.
  • système composé de PAM (protospacer adjacent motif)+Target(séquence complémentaire), du gRNA (guide RNA) et de Cas9.
33
Q

Quels sont les deux moyens pour faire l’édition du génome avec CRISPR-Cas9 ?

A
  • Par NHEJ (non-homologous end-joining)
    → mène souvent à réparation défectueuse/création de modification
  • Par HDR (homology directed repair)
    → fournit une matrice pour réparer la coupure: changement spécifique est introduit au génome.
34
Q

Qu’est-ce que le western-blot ?

A
  • Le western-blot, ou immunobuvardage, est une méthode rapide et sensible pour caractériser les protéines purifiées ou des mélanges complexes de protéines.
  • Implique le transfert de protéine sur membrane de nitrocellulose ou PVDF afin d’effectuer l’immunodétection des protéines.
35
Q

Quelles techniques sont combinées dans le western-blot ?

A

Le western-blot combine la résolution des gels d’électrophorèse et la spécificité de l’immunodétection par des anticorps monoclonaux et polyclonaux.

36
Q

Quelle est la différence entre un Ac polyclonaux et monoclonaux ?

A
  • Ac polyclonal : reconnaissance de plusieurs épitopes de la protéine
  • Ac monoclonal : reconnaissance d’un seul épitope de la protéines
37
Q

Qu’est-ce qu’un épitope ?

A

Déterminant antigénique
- séquence d’aa reconnu par une immunoglobuline.
- un Ag peut avoir plein d’épitopes différents

38
Q

Qu’est-ce qu’un épitope linéaire ?

A
  • tous les aa sont contigus dans la structure primaire
  • composé de 4 à 6 résidus.
39
Q

Qu’est-ce qu’un épitope conformationnel ?

A
  • composé de séquences non contiguës mais rapprochées dans la structure tertiaire
  • plus complexe, contenant jusqu’à 20 résidus.
40
Q

Donnez les composantes de la structure schématique d’une Ig/Ac.

A
  • tétramère composé de 2 chaînes lourdes glycosylées et de 2 chaînes légères, liées par des ponts disulfure, avec une structure en Y.
  • Fragment Fab
  • Région C-terminale des chaines lourdes.
41
Q

Qu’est-ce que le fragment Fab dans une molécule d’immunoglobuline ?

A
  • contient les sites de liaison spécifiques à l’antigène ou épitope.
  • assemblage des régions N-terminales des chaînes lourdes et légères
  • deux molécule par Ig.
42
Q

Quel est le rôle de la région C-terminale des chaînes lourdes dans une molécule Ig ?

A

région effectrice dans le contexte de la fonction des anticorps lors de la réponse immunitaire.

43
Q

Quelles sont les caractéristiques des régions hypervariables des Ig ?

A
  • Les régions hypervariables des Ig contiennent des régions variables de 5 à 10 acides aminés
  • constituent le site de liaison à l’antigène grâce à l’assemblage des chaînes lourdes et légères.
44
Q

Quelle est l’étape préalable au Western-Blot?

A

Transfert du gel sur membrane liquide ou semi-sec (humide et + efficace que liquide):

Pour détecter les protéines spécifiquement après éléctrophorèse SDS- PAGE à l’aide d ’anticorps, il faut d’abord immobiliser (par transfert électrique) les protéines sur une membrane.

45
Q

Quelle est la direction du transfert des protéines lors du transfert électrique ?

A

Les protéines sont transférées de la direction - (cathode) vers la direction + (anode) sur la membrane.

46
Q

Comment fonctionne la détection des Ag par colorimétrie ?

A
  1. Ac primaire reconnait Ag sur la prot d’intérêt qui est fixée sur la membrane.
  2. Ac secondaire reconnait le Fc du Ac primaire-spécifique. le Fc du Ac secondaire est lié à une enzyme permettant sa détection (couleur sur membrane)

(dessin p41)

47
Q

Donnez un exemple de détection des Ag par colorimétrie (enzyme → substrat → couleur du précipité).

(idk if we have to know them)

A

enzyme → substrat → couleur su précipité

Phosphatase alcaline → BCIP/NBT → Noir/violet
Horseradish peroxidase → DAB → Brun

48
Q

Comment se fait la détection des Ag par chimiluminescence?

A
  • Même principe que par colorimétrie avec les Ac primaires et secondaires.
  • HRP produit signal (luminol) proportionnel à la quantité de prot.
  • Exposition sur film X-Ray → détection par caméra par CCD.
49
Q

Vrai ou Faux.

Western-Blot est quantitative.

A

Faux

La technique est semi-quantitative.

50
Q

Quelles sont les étapes de la détection des protéines par ELISA ? (5)

A
  1. Ac de Capture
    → immobilisation de Ac sur pétri
  2. Blocking
    → site vide de la plaque sont bloqué avec des prot cible
  3. Incubation des échantillons
    → il y a la prot cible sur les capture Ac
  4. Detection des Ac
    → ajout d’Ac biotinylé
  5. Enzyme-Avidin
    → complexe HPR-Avidine ajouté suivi du substrat
51
Q

Comment détermine-t-on la concentration d’une protéine dans les échantillons lors d’un test ELISA ?

A

L’utilisation d’une courbe d’étalonnage permet de déterminer la concentration d’une protéine dans nos échantillons.

Travaux pratiques 2 (8 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions