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Travaux pratiques 2 > Cours 5 > Flashcards

Cours 5 Flashcards

1
Q

Quelles sont les méthodes d’analyse de plasmide? (3)

A
  • Séquençage
  • Analyse par digestion, carte de restriction
  • Analyse par hybridation spécifique
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Q

Donnez les étapes pour l’analyse par digestion (carte de restriction). (3)

A
  • digestion par enzymes de restriction spécifiques
  • migration sur gel d’agarose
  • Analyse du profile de migration
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3
Q

Qu’est-ce que l’analyse par hybridation spécifique?

A

Une sonde marquée est utilisée pour identifier la présence d’une séquence d’ADN spécifique.

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4
Q

Qui est le scientifique associé au séquençage Sanger ? (freebie)

A

Frederick Sanger

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Q

Vrai ou Faux
Les didésoxynucléotides (ddNTP) n’ont pas de OH en 3’.

A

Vrai

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6
Q

Quel est le rôle des ddNTP dans la synthèse de l’ADN ?

A

Les ddNTP mettent fin à la croissance d’une chaîne d’ADN puisqu’ils n’ont pas le 3’ OH pour continuer à attaquer les phosphates d’un autre dNTP.

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7
Q

Quels sont les composantes du marquage terminal? (5)

A
  • ADN matrice
  • dNTP
  • Amorce
  • ADN polymérase
  • ddNTP marqués par fluorescence
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8
Q

Vrai ou Faux.
Un petit fragment va traverser le gel plus vite et va se retrouver en bas du gel.

A

Vrai.

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9
Q

Expliquez brièvement comment fonctionne la technique de Sanger.

A

L’amorce est hybridé avec le plasmide.

  • l’ADN polymérase va allonger l’amorce avec les dNTP, mais des fois elle met des ddNTP qui va arrêter l’allongement.
  • On se retrouve alors avec plein de fragments de différentes tailles.
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10
Q

Les résultats d’un séquençage de Sanger sont sous formes de graphique. Quels sont les axes d’un tels graphique?

A

axe des x: temps de migration (taille de l’ADN)

axe des y: intensité du signal fluorescent.

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11
Q

Que représente la lettre “N” dans une séquence de nucléotides ? (not sure about this)

A

La lettre “N” dans une séquence de nucléotides représente un nucléotide indéterminé, c’est-à-dire qu’il peut être n’importe quel des quatre nucléotides (A, T, C, G).

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12
Q

Qu’est-ce que le séquençage de nouvelle génération (NGS) ?

A

méthode avancée de séquençage de l’ADN qui permet de séquencer rapidement et à grande échelle des millions de fragments d’ADN simultanément.

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13
Q

Quels sont les avantages du séquençage de nouvelle génération par rapport aux méthodes traditionnelles ?

A
  • vitesse de séquençage accrue,
  • capacité à traiter des échantillons complexes
  • réduction des coûts
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14
Q

Vrai ou Faux
Les NGS font des lectures longues et les TGS font des lectures courtes.

A

Faux,
C’est l’inverse.
TGS = Longue lecture
NGS = Lecture courtes

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15
Q

Quelles sont les étapes clés du processus de séquençage de nouvelle génération ? (3)

A
  • préparation de la bibliothèque d’échantillons
  • amplification clonale
  • séquençage cyclique
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16
Q

Quels sont les composantes du truc qui se fait séquencer dans la préparation de la bibliothèque d’échantillon? (2)

A
  • ADN à séquencer
  • Adaptateur (amorce + capture), de part et d’autre de l’ADN.
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17
Q

Que contient la cellule de flux (flow cell)?

A

Des petits oligonucléotide d’ADN qui sont fixé physiquement sur la cellule (la où les fragments se fixe).

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18
Q

Pourquoi on utilise un adaptateur dans la préparation d’échantillon?

A
  • Sert à la fixation de l’ADN sur la cellules
  • Sert à l’hybridation pendant l’étape de séquençage.
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19
Q

L’amplification clonale dans le NGS se fait par pontage. Expliquez comment cela fonctionne.

A

aller voir la diapo 14, c’est trop long à expliquer. bisous

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20
Q

Vrai ou Faux.
Les étapes de l’amplification clonale sont: création d’un cluster, dénaturation, clivage d’un brin, séquençage.

A

Vrai

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21
Q

Pour les NGS
Si on a une perte de synchronisation, est-ce qu’on va avoir une lecture courte ou longues? (freebie but important)

A

lecture courte

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22
Q

À quoi correspond le séquençage cyclique?

A
  • utilisation de terminateurs fluorescent à chimie réversible.
  • blocage et fluorescence éliminés
23
Q

Donnez les étapes du séquençage clonale. (5)

A
  • ajouter un seul nucléotide et l’imager
  • retirer le signal/blocage
  • ajouter le nucleotide suivant et l’imager
  • retirer le signal/blocage
  • répété jusqu’à ~300 fois (c’est-à-dire lecture courte)
24
Q

Comment fonctionne la configuration en quatre couleurs dans le séquençage Illumina ?

A

La configuration en quatre couleurs dans le séquençage Illumina utilise des nucléotides marqués par des fluorophores différents pour identifier chaque base lors du cycle d’imagerie.

25
Q

Quelles technologies sont le séquençage de troisième génération ? (2)

A
  • Pacific Biosciences
  • Oxford Nanopore (le courant est mesuré)
26
Q

Quel est l’avantage aux TGS? Quel est leur taux d’erreur?

A
  • longue lectures (du niveau des Mb alors que lecture courte dont environ 50 nucléotide)
  • 10-15% d’erreurs.
27
Q

Quels sont les étapes pour la préparation d’une carte de restriction (digestion diagnostique)? (3)

A
  1. Digérer l’ADN avec une ou plusieurs enzymes de restrictions
  2. Déterminer la taille des fragments générés par électrophorèse
  3. Utiliser cette information pour prédire la position des sites de restrictions sur l’ADN.
28
Q

Combien de bandes observe-t-on sur un gel d’agarose si l’ADN linéaire a 1, 2, 3… sites de restriction ?

A

n+1 (n=nombre de site de restriction)
- 1 site = 2 bandes
- 2 sites = 3 bandes
- 3 sites = 4 bandes

29
Q

Qu’est-ce qu’une digestion simple et à quoi sert-elle ? (2)

A

1) utiliser des enzymes de restriction pour vérifier la taille totale du plasmide et la présence de l’insert.
2) déterminer l’orientation de l’insert.

30
Q

Combien de bandes sont prévues pour un plasmide (ADN circulaire) avec 1,2,3… sites de restriction ?

A

n (n=nombre de site de restriction)
- 1 site = 1 bande
…

31
Q

Qu’est-ce qu’une carte de restriction/fingerprinting dans l’analyse de plasmide ?

A

Une carte de restriction est une représentation des sites de coupure d’enzymes de restriction sur un plasmide, permettant d’identifier et de caractériser le plasmide.

32
Q

Vrai ou Faux.
L’orientation de l’insert est importante dans le fingerprinting.
Pourquoi?

A

Oui, l’orientation est importante pour savoir si le gène est sous le contrôle d’un promoteur présent dans le vecteur. Donc, une seule orientation possible si on a un promoteur.

33
Q

Que représente ‘Uncut’ dans le contexte de l’analyse par carte de restriction ?

A
  • Il représente l’ADN non coupé par les enzymes de restriction.
  • Il ne migre pas parce qu’il est surenroulé.
34
Q

Donnez les étapes pour faire/résoudre une carte de restriction.
(faite l’exercice dans les ndc, c’est mieux pour comprendre)

A
  1. Déterminer la taille du plasmide à partir des digestions ne donnant qu’un seul fragment.
  2. Déterminer le nombre de site par enzymes selon le nombre de bandes par enzyme.
  3. Placer les sites selon leur correspondance de taille et d’orientation.
35
Q

Quelles sont les différentes méthodes de détection par hybridation, leurs molécules cibles et leurs sondes ?

A

Essai → Molécules cibles → Sondes

Southern-blot → ADN → ADN ou ARN
Northern-blot → ARN → ADN ou ARN
Hybridation de colonies → ADN bactérien → ADN
Dot-Blot → ADN → ADN

36
Q

Comment les propriétés d’hybridation des acides nucléiques peuvent-elles être utilisées?

A

pour détecter une séquence d’intérêt dans un mélange de molécules d’ADN ou ARN.

37
Q

Quelles sont les propriétés de l’hybridation des a.n. ?

A
  • Sonde ADN ou ARN = séquence complémentaire à l’une des molécules d’ADN ou ARN permettant de la distinguer dans un mélange complexe
  • La sonde doit être “marquée” afin d’être différenciable du pool d’acides nucléiques
38
Q

Qu’est-ce qui détermine la stringence dans l’hybridation et comment est-elle influencée ?

A
  • concentration en sel et la température.
  • ↓ T, ↑ [sel] = low stringence (hybridation non spécifique mais multiple)
  • ↑ T, ↓ [sel] = high stringence (hybridation plus spécifique mais moindre)
39
Q

Vrai ou Faux.
Dans un protocole “basique”, on commence par un high stringence puis ensuite un low stringence.

A

Faux.

On commence par le low stringence (beaucoup de liaisons) et ensuite augmenter la stringence pour réduire la liaison non spé et maintenir la liaison spé.

(si on passe direct au high strin, on va avoir un faible signal à la fin prcq il n’y aura pas beaucoup de sondes hybridées)

40
Q

Quelles sont les méthodes de marquage des sondes? (3)

A
  • marquage par incorporation de nucléotide radioactif
  • marquage par incorporation de nucléotide marqué avec un haptène (comme la biotine ou la digoxygénine)
  • marquage par incorporation de nucléotide fluorescent (fluorochrome).
41
Q

Quelle est la stratégie d’utilisation d’une sonde dans l’analyse par hybridation spécifique ?

A

On prend un mélange de molécules d’ADN qu’on dénature et qu’on mélange et qu’on laisse hybrider avec la sonde marquée.

42
Q

Northern-Blot VS Southern-Blot.
Donnez la différence entre les méthodes.

A
  • Nothern-Blot: détecter spécifiquement une séquence d’ARN dans un mélange complexe séparé par électrophorèse.
  • Southern-Blot: détecter spécifiquement une séquence d’ADN dans un mélange complexe séparé par électrophorèse.
43
Q

Northern-Blot VS Southern-Blot.
Donnez les similitudes entre les méthodes.

A
  • Les a.n. sont transférés et immobilisés sur une membrane (nitrocellulose) après l’électrophorèse.
  • L’hybridation de la sonde est réalisée sur la membrane.
44
Q

Quel est le principe/étapes des Northern-Blot et le Southern-Blot? (5)

A
  1. Electrophorèse/migration
  2. Transfert sur membrane chargée +
  3. Hybridation de la sonde d’intérêt (importance de stringence)
  4. Lavage des hybridations par lavage (importance de stringence)
  5. Révélation par autodiagram
45
Q

Pourquoi utilise-t-on une membrane chargée positivement dans le Southern/Nothern-Blot ?

A

La membrane chargée positivement aide à fixer l’ADN transféré, facilitant ainsi l’hybridation avec la sonde d’intérêt.

46
Q

Comment fonctionne l’hybridation de colonies de bactéries ?

A
  1. Fixation des colonies bactériennes sur une membrane (Dénaturation d’ADN + autres étapes)
  2. Ajout de sonde marquée qui s’hybride spécifiquement avec les colonies contenant la séquence d’ADN d’intérêt.
  3. L’identification du clone d’intérêt se fait par autoradiographie.
  4. Comparaison avec la culture de départ et mettre la colonie positive dans un milieu de culture liquide.
47
Q

Comment fonctionne le Dot-Blot ?

A
  • dépôt d’ADN dans chacun des puits
  • Transfert de l’ADN sur la membrane par aspiration (pompe à vide)
  • Reste des étapes semblables au N/S-Blot.

Il n’y a pas d’électrophorèse, donc on n’a pas d’informations sur la taille des fragments.

48
Q

Quelles sont les méthodes et leurs caractéristique pour la quantification de l’expression des gènes par PCR ?

A
  • PCR: Analyse sur gel d’agarose & Semi-quantitatif
  • PCR quantitative/temps réel: Analyse de l’incorporation de sondes fluorescente & Quantitatif
49
Q

Quelles sont les sondes utilisées dans la PCR quantitative ? Comment fonctionnent-t-elles ?

A
  • SYBR green: fluorescence lorsque lié à ADN double brin
  • TaqMan Probes : fluorescence lorsque le quencher est libéré
50
Q

Fill in the blanks

  • Le SYBR green non lié émet (…) de fluorescence.
  • La fluorescence est (…) par l’incorporation dans les doubles brins d’ADN.
  • La fluorescence est mesurée (…) de l’élongation de chaque cycle de PCR pour détecter (…) d’ADN amplifié
  • La fluorescence détectée à chaque cycle est (…) à la quantité d’ADN qu’on avait au départ
A
  • Le SYBR green non lié émet très peu de fluorescence.
  • La fluorescence est augmentée par l’incorporation dans les doubles brins d’ADN.
  • La fluorescence est mesurée à la fin de l’élongation de chaque cycle de PCR pour détecter l’augmentation d’ADN amplifié.
  • La fluorescence détectée à chaque cycle est proportionnelle à la quantité d’ADN qu’on avait au départ.
51
Q

Quelle est la différence majeure entre la RT-qPCR et la qPCR?

A
  • La RT-qPCR se fait en une étape, alors que la qPCR se fait en deux étapes (reverse transcriptase et la qPCR).
  • La RT-qPCR fait la reverse transcriptase (ARN → ADN) avec le reste de la réaction, alors que le qPCR les sépare.
52
Q

Comment fonctionne en “détails” la technologie TaqMan en PCR quantitative ?

A
  • Utilisation de sonde spécifique, marquée avec un dye et un quencher, qui s’hybride à la séquence cible. (le quencher absorbe l’énergie du dye lorsqu’ils sont à côté)
  • Pendant la PCR, la sonde est clivée, libérant le dye et produisant un signal fluorescent proportionnel à la quantité d’ADN amplifié, mesuré en temps réel.
53
Q

Comment se fait l’analyse en PCR quantitative ?

A
  • L’analyse en PCR quantitative suit l’accumulation de produit d’amplification à chaque cycle en détectant le signal fluorescent émis.
  • Cette approche permet de quantifier précisément le nombre de copies d’ADN dans l’échantillon initial, en se basant sur le cycle seuil (Ct) où le signal dépasse un certain niveau.

Travaux pratiques 2 (8 decks)

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