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Travaux pratiques 2 > Cours 6 > Flashcards

Cours 6 Flashcards

1
Q

Dans l’exercice 2 des diapositives du cours, deux vecteurs sont présentés. Ces derniers sont-ils les mêmes?

A

Oui, ils sont les mêmes. Les cadres de restrictions sont les mêmes, mais la symétrie est différente.

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2
Q

Une électrophorèse présente 3 puits: Xbal, Xbal + HindIII, et HindIII. Les bandes présentées dans le deuxième puits seront-elles les mêmes que dans les puits #1 et #3, ou seront-elles différentes?

A

Les bandes seront de poids différents, mais la somme sera toujours la même.

Exemple: la bande de 3.3 kb dans Xbal sera séparée en 2.0 kb et 1.3 kb.

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3
Q

Quels sont les facteurs influençant le choix du système? (6)

A
  • But expérimental;
  • Rendement;
  • Besoin de purification;
  • Modification post-traductionnelles;
  • Difficulté expérimentale;
  • Coût.
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4
Q

Quels sont les systèmes possibles pouvant être utilisés pour permettre l’expression de protéines recombinantes? (6)

A
  • Bactéries : E. coli;
  • Levures : S. cerevisiae;
  • Cellules d’insectes/Baculovirus;
  • Système de reticulocytes: transcription/traduction in vitro;
  • Cellules de Mammifère en culture;
  • Animaux transgéniques (mouches, souris etc….).
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5
Q

Quels sont les buts possibles des expériences in vitro? (5)

A
  • Réaction enzymatique;
  • Interactions protéiques;
  • Étude de structure;
  • Génération d’antigènes;
  • Production de ligand.
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6
Q

Quels sont les buts possibles des expériences in vivo? (5)

A
  • Fonction biologique;
  • Interactions protéiques;
  • Activation enzymatique;
  • Phosphorylation;
  • Régulation de l’expression.
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7
Q

Quel est le système d’expression qui est favorisé en laboratoire? Quels sont les effets positifs/négatifs de celui-ci?

A

Les bactéries sont favorisées.

  • Positif: utilisation facile, coûts bas, grand rendements.
  • Négatif: aucunes modifications post-traductionnelles possibles.
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8
Q

Quel est le système d’expression qui n’est pas favorisé en laboratoire? Quels sont les effets positifs/négatifs de celui-ci?

A

Les cellules de mammifères ne sont pas favorisées.

  • Positif: modifications post-traductionnelles possibles, permet la production de protéines seulement formées par mammifères.
  • Négatif: utilisation difficile, coûts élevés, bas rendements.
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9
Q

Vrai ou faux? Le choix de l’organisme est dédié en fonction du but expérimental.

A

Vrai.

Les bactéries/levures sont surtout pour produire grandes quantités de protéines pour expériences in vitro (qui ne sont pas modifiées post-traductionnellement).

Les cellules de mammifères sont surtout pour valider des résultats, surtout pour l’étude des protéines.

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10
Q

Vrai ou faux? Il est impossible pour une bactérie d’entreprendre des modifications post-traductionnelles.

A

Faux. Il fut récemment découvert que la bactérie est en mesure de phosphoryler/glycosyler à faible échelle.

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11
Q

Vrai ou faux? Le choix du vecteur dépend de l’organisme dans lequel la protéine sera exprimée.

A

Vrai. La séquence promotrice permettant d’induire la transcription de l’ADN complémentaire inséré dans le vecteur en ARNs messagers est spécifique à l’organisme-hôte.

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12
Q

Qu’est-ce que les vecteurs incorporent afin de permettre la purification ou l’isolation subséquente des protéines produites? (2)

A
  • Différents promoteurs (plus ou moins forts);
  • Différentes étiquettes.
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13
Q

Quels sont les facteurs importants présentés sur un vecteur de réplication? (3)

A
  • Polylinker, site de clonage;
  • Marqueur de sélection;
  • Origine de réplication.
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14
Q

Dans l’exemple de pET-28a, quelle est la fonction du domaine rbs?

A

Permet au ribosome E.coli de se lier et commencer la traduction des protéines.

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15
Q

Vrai ou faux? Dans l’exemple de pET-28a, le promoteur utilisé est celui de E.coli.

A

Faux, le promoteur utilisé est le T7 promoteur primer, puisqu’il est plus stable et précis.

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16
Q

Dans un système pET/BL21(DE3), qu’est-ce que l’expression inductible?

A

C’est le fait que l’opérons peut être régulé par un facteur externe, tel que l’IPTG.

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17
Q

Dans le système pET, pourquoi est-ce nécessaire d’utiliser des souches bactériennes BL21(DE3)?

A

Parce que sinon, la transcription de l’ARN polymérase sera faible, et la stimulation sera moindre.

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18
Q

Qu’est-ce que le gène represseur lac (lacI)?

A

Facteur de répression qui se lie étroitement à l’opérateur.

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19
Q

Qu’est-ce que l’arabinose?

A

Sucre monosaccharidique métabolisé dans les bactéries.

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20
Q

Lorsque l’arabinose est absente, qu’arrive-t-il? La transcription est permise ou empêchée?

A

Le complexe O2 - I1 est formé, ce qui empêche la transcription. L’ARN polymérase ne peut pas se lier à cause de la boucle 1-2.

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21
Q

Lorsque l’arabinose est présente, qu’arrive-t-il? La transcription est permise ou empêchée?

A

Le complexe I1 - I2 est formé, ce qui permet la transcription. L’ARN polymérase peut se lier, puisque la boucle 2-3 est formée.

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22
Q

Qu’est-ce que la protéine CAP et quel est son rôle dans la transcription en relation avec l’AMPc?

A

La protéine CAP soutient la transcription. Lors de la présence d’AMPc, cette dernière se lie à la CAP pour augmenter la stimulation.

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23
Q

Quel est l’effet de la concentration de glucose sur la concentration d’AMPc?

A

Plus le glucose augmente, plus l’AMPc diminue.

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24
Q

Le promoteur T7lac est souvent retrouvé dans quel vecteur?

A

Dans les vecteurs pET.

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25
Q

Le promoteur araBAD est souvent retrouvé dans quel vecteur?

A

Dans les vecteurs pBAD.

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26
Q

Qu’est-ce que l’élément TRE, et quel est son rôle dans l’expression de la tetracycline?

A

Un TRE (trans-regulatory element) est composé de 7 tetO (tetracycline operator).

Il est considéré comme étant “l’élément réponse”.

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27
Q

Lorsqu’il y a le tTA lié au TRE en absence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?

A

tTA: tetracycline-controlled transactivator.

La transcription à lieu.

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28
Q

Lorsqu’il y a le tTA lié au TRE en présence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?

A

La transcription n’a pas lieu, car tet se lie à tTA, empêchant ainsi à tTA de se lier à TRE.

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29
Q

Quelle est la composition de tTA? (2)

A
  • tetR : répresseur tet;
  • VP16.
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30
Q

Lorsqu’il y a la présence de rtTA en absence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?

A

rtTA: reverse tTA.

L’absence de tet empêche le rtTA de se lier au TRE, ce qui bloque la transcription.

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31
Q

Lorsqu’il y a la présence de rtTA en présence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?

A

La présence de tet permet de former un complexe tet-rtTA, ce qui permet la fixation de TRE, et donc permet la transcription.

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32
Q

Quelle est la composition de rtTA? (2)

A
  • tetR mutant;
  • VP16.
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33
Q

Qu’est-ce que le VP16?

A

Virion protein 16.

Source : https://www.addgene.org/col lections/tetracycline/

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34
Q

Qu’est-ce que la doxycycline et quelle est sa différence comparément à la tétracycline?

A

La doxycycline permet de voir une voie alternative à la tetracycline.

La différence est le placement d’un groupement hydroxy sur la molécule (tet = 2ieme ring, dox = 3ieme ring).

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35
Q

Qu’est-ce que l’induction positive? Donne un exemple.

A

L’addition d’un inducteur permet la liaison du complexe inducteur-activateur à l’opéron (où l’activateur n’était pas initialement attaché à l’opéron), ce qui permet la transcription.

Exemple: tetracycline on.

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36
Q

Qu’est-ce que l’induction négative? Donne un exemple.

A

L’addition d’un inducteur permet le détachement du complexe inducteur-répresseur de l’opéron (où le répresseur était initialement lié à l’opéron) ce qui permet la transcription.

Exemple: IPTG dans l’opéron lac.

37
Q

Qu’est-ce que la répression positive? Donne un exemple.

A

L’addition d’un répresseur forme le complexe activateur-répresseur, ce qui détache le complexe de l’opéron (où l’activateur était initialement attaché à l’opéron), ce qui empêche la transcription.

Example: tetracycline off.

38
Q

Qu’est-ce que la répression négative? Donne un exemple.

A

L’addition d’un corépresseur forme le complexe répresseur-corépresseur, ce qui permet son attachement à l’opéron (le répresseur n’étant pas initialement attaché à l’opéron), ce qui empêche la transcription.

Example: opéron trp.

39
Q

Vrai ou faux? Les différentes souches d’E.coli pour soit le clonage, soit l’expression sont facilement interchangeables.

A

Faux. Il est rarement possible d’interchanger les souches d’E.coli entre clonage et expression, puisque les buts scientifiques sont différents.

40
Q

Quelles sont des modifications standards pouvant être faites aux souches d’E.coli? (4)

A
  • ompT: élimine une protéase de la membrane externe;
  • Ion protease: élimine la protéase;
  • hsdSB: pas de système de méthylation/restriction;
  • dcm: pas de cytosines méthylées.
41
Q

Il y a aussi la possibilité d’avoir des problèmes spécifiques concernant l’expression de protéines dans les souches d’E.coli. Quelles sont des solutions possibles? (2)

A
  • Modification de l’environnement de repliement des protéines (l’environnement redox, ou la co-expression avec un facteur nécessaire, par exemple un chaperon ou une kinase);
  • L’utilisation des codons de E. coli par rapport à celle du gène étudié (ARNt supplémentaires, ou gène synthétique).
42
Q

Quelle est la souche bactérienne d’E.coli la plus souvent utilisée?

A

DE3.

43
Q

Quels sont les points clés pour le clonage dans un vecteur? (4)

A
  • Importance du sens de clonage;
  • Bactérie ne fait pas d’épissage;
  • Ajout d’une étiquette en N-terminal de la protéine à exprimer (5’ du cDNA);
  • Ajout d’une étiquette en C-terminal de la protéine à exprimer (3’ du cDNA).
44
Q

Quels sont les éléments clés du sens de clonage? (3)

A
  • Promoteur;
  • ATG;
  • Codon stop (TGA, TAA, TAG).
45
Q

Concernant le fait que la bactérie ne fait pas d’épissage, comment est-ce que cela impacte la séquence de l’insert?

A

L’insert est l’ADNc obtenu à partir d’un ARNm mature, donc est dépourvu d’introns.

46
Q

Quels sont les éléments à prendre en considération lors de l’ajout de l’étiquette en 5’ du cDNA? (2)

A
  • Nécessite une clonage « en phase » (l’ORF de l’étiquette doit être en phase avec l’ORF du cDNA);
  • L’ATG utilisé est celui de l’étiquette (présent sur le plasmide) pour la traduction de la protéine de fusion.
47
Q

Il faut faire attention de ne pas introduire quoi entre l’étiquette et le cDNA lors du clonage?

A

Un codon STOP.

48
Q

Quels sont les éléments à prendre en considération lors de l’ajout de l’étiquette en 3’ du cDNA? (3)

A
  • Le STOP du cDNA ne doit pas être conservé dans l’insert;
  • Le STOP utilisé sera celui après l’étiquette disponible sur le plasmide;
  • L’ATG utilisé sera celui du cDNA.
49
Q

Vrai ou faux? Le moment de l’induction de la bactérie est aléatoire.

A

Vrai. Il faut choisir le moment de l’induction en fonction de la bactérie utilisée.

50
Q

Vrai ou faux? Les cellules meurent rapidement à cause de leur faible taux de croissance et leur synthèse très faible de protéines recombinantes.

A

Faux. Les cellules meurent rapidement à cause de leur fort taux de croissance et leur synthèse très importante de protéines recombinantes.

51
Q

Quel est l’impact de la mort cellulaire sur l’expression des protéines recombinantes?

A

Cela limite l’expression des protéines recombinantes.

52
Q

Quelle est la solution à prendre pour limiter la mort des cellules exprimant les protéines recombinantes?

A

Faire un découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d’intérêt) et une phase d’expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine).

53
Q

À quoi servent les biréacteurs en production industrielle?

A

Permettent le contrôle de température et oxygénation des cultures.

54
Q

Vrai ou faux? Les vecteurs d’expression permettent seulement de produire des protéines in vivo.

A

Faux, la production in vitro est possible.

55
Q

Un certain promoteur est très important dans les vecteurs d’expression in vitro. Lequel est-il?

A

Promoteur T7.

Présence du promoteur T7 dans le plasmide, ainsi que l’utilisation de l’ARN polymérase T7.

56
Q

Quel est le but d’utiliser des étiquettes et protéines de fusion?

A

Afin de faciliter la purification et l’analyse de protéines.

57
Q

La poly-His (6X) permet de faire quoi, en terme de purification par affinité?

A

La purification permet de former un complexe d’interactions entre les groupements azotés et le nickel.

Elution par l’imidazole, EDTA ou faible pH.

58
Q

La strep-tag II permet de faire quoi, en terme de purification par affinité?

A

Strep-tactin est lié à la résine. Strep-tag II (attaché à une protéine recombinante) se lie à strep-tactin.

Elution par desthiobiotine permet le relâchement du complexe strep-tag II / protéine recombinante.

59
Q

Quelles sont les étapes de la purification de protéines par fusion GST? (3)

A

1) Production de la protéine (lisant bactérien);
2) Ajout de billes de sépharose couplées au glutathion;
3) Élution de la protéine avec le glutathion.

60
Q

Que fait le complexe GST sur la protéine en présence de gluthathion?

A

Les billes de sépharose présentent des molécules de glutathion, ce qui permet au complexe GST de s’y lier.

61
Q

Vrai ou faux? Les lavages permettent d’éliminer toutes autres protéines non liées au glutathion.

A

Vrai.

62
Q

Le GST lie quelle partie du glutathione?

A

La partie réduite du glutathione est liée au GST.

63
Q

Quels sont les deux types de gels dans l’électrophorèse SDS-PAGE?

A
  • Entassement (stacking);
  • Séparation (running).
64
Q

Quelle est la fonction du gel d’entassement?

A

Sert à la concentration des protéines de l’échantillon de façon à ce qu’elles entrent toutes en même temps dans le gel de séparation.

65
Q

Quelle est la fonction du gel de séparation?

A

Permet la séparation des protéines selon leur poids moléculaire, les plus grosses migrant le moins rapidement.

66
Q

Vrai ou faux? Le gel d’entassement est plus basique que le gel de séparation.

A

Faux. Le gel d’entassement a un pH de 6.8, tandis que le gel de séparation a un pH de 8.8.

67
Q

Dans le gel, quelle est la fonction du bis-acrylamide?

A

Agit comme agent pontant.

68
Q

Quels sont les deux éléments du gel, et que constituent-ils?

A

Acrylamide et bis-acrylamide.

Constituent le réseau de mailles à travers lequel les protéines devront passer.

69
Q

Quel élément initie la polymérisation?

A

L’APS (ammonium persulfate).

70
Q

Quel élément permet de catalyser la réaction?

A

Le TEMED.

71
Q

Quelle est la fonction du tampon de Laemmli?

A

Permet la dénaturation des protéines afin de permettre la migration selon la masse moléculaire.

72
Q

De quoi est composé le tampon d’échantillon de Laemmli? (5)

A
  • SDS 2%;
  • β-mercaptoéthanol ou DTT 100 mM;
  • Glycerol 10%;
  • Bleu de bromophénol 0,01%;
  • 62,5 mM Tris-HCL pH 6,8.
73
Q

À quoi sert le SDS dans le tampon Laemmli? (2)

A
  • Dénaturer les protéines;
  • Charger les protéines négativement: masque la charge intrinsèque des protéines. Le ratio charge/masse est identique pour toutes les protéines.
74
Q

À quoi sert le β-mercaptoéthanol dans le tampon Laemmli?

A

Dissociation des ponts disulfures.

75
Q

À quoi sert le glycérol 10% dans le tampon Laemmli?

A

Augmente la densité (donc alourdit) les échantillons, ce qui facilite la migration.

76
Q

À quoi sert le bleu de bromophénol 0.01% dans le tampon Laemmli?

A

Visualisation des protéines lors du dépôt et le front de migration.

77
Q

Après avoir placé l’échantillon dans le tampon, que faut-il faire? À quoi est-ce que cela sert?

A

Il faut faire chauffer le tout à 95°C pendant 5 minutes.

Cela sert à la dénaturation des protéines.

78
Q

Puisque l’électrophorèse passe de négatif à positif, cela permet de faire la migration de quel type de protéines?

A

Permet la migration de protéines négatives.

hinhin question piège

79
Q

Vrai ou faux? Lorsque l’échantillon présente des protéines de petites tailles, il est préférable d’utiliser un gel de basse concentration.

A

Faux. Il est préférable d’utiliser un gel de plus haute concentration, vu que cela permet de faire un plus grand retardement protéique.

80
Q

Si les grosses protéines sont bien séparées dans un gel moins concentré, qu’arrivera-t-il aux protéines miniatures?

A

Elles seront perdues (sorties du gel avec le front de migration).

81
Q

À quoi sert la coloration du gel avec le bleu de Coomassie?

A

Cette coloration non-spécifique permet de lier Coomassie G-250 aux acides aminés chargés positivement et aux chaînes latérales aromatiques.

82
Q

Vrai ou faux? Il n’existe seulement le bleu de Coomassie pour faire la coloration non-spécifique.

A

Faux. Il y a plusieurs autres méthodes de coloration non-spécifiques.

83
Q

Dans les laboratoires, il faut faire attention de ne pas dénaturer la protéine. Quelles sont deux techniques permettant l’extraction par destruction mécanique? Quelle précaution faut-il prendre?

A
  • Sonicateur;
  • Rupture de cellules par pression.

Il faut faire le tout sur glace, car l’utilisation de ces machine génère beaucoup de chaleur.

84
Q

Quelle est la méthode d’extraction protéique la plus importante?

A

Par lyse cellulaire.

85
Q

Quels sont les types de détergents utilisés pour lyse cellulaire? (2) Comment fonctionnent-ils?

A
  • Les détergents ionique sont dénaturants. Ils dissocient les interactions protéine-protéine. Ils ont une très bonne capacité à solubiliser les protéines membranaires;
  • Les détergents non-ioniques brisent les interactions lipide-lipide et lipide-protéine, mais sont non-dénaturants. Ils permettent l’étude des interactions protéine-protéine qui ne sont pas détruites en leur présence. Les protéines isolées maintiennent leur structure native ainsi que leurs fonctions (enzymatiques ou non).
86
Q

Donne un exemple d’un détergent ionique.

A

SDS.

87
Q

Donne un exemple d’un détergent non-ionique.

A

Triton X-100.

88
Q

Pourquoi faut-il faire la lyse sur glace?

A

Afin de protéger les protéines de la dégradation, car la lyse active les protéases. On utilise aussi des inhibiteurs de protéases dans le tampon de lyse.

89
Q

Si un détergent est très ionique, quel sera l’impact sur la protéine?

A

Il aura une plus grande capacité de solubiliser les protéines, ce qui veut donc dire qu’il aura tendance à les dénaturer.

Travaux pratiques 2 (8 decks)

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