Cours 6 Flashcards
Dans l’exercice 2 des diapositives du cours, deux vecteurs sont présentés. Ces derniers sont-ils les mêmes?
Oui, ils sont les mêmes. Les cadres de restrictions sont les mêmes, mais la symétrie est différente.
Une électrophorèse présente 3 puits: Xbal, Xbal + HindIII, et HindIII. Les bandes présentées dans le deuxième puits seront-elles les mêmes que dans les puits #1 et #3, ou seront-elles différentes?
Les bandes seront de poids différents, mais la somme sera toujours la même.
Exemple: la bande de 3.3 kb dans Xbal sera séparée en 2.0 kb et 1.3 kb.
Quels sont les facteurs influençant le choix du système? (6)
- But expérimental;
- Rendement;
- Besoin de purification;
- Modification post-traductionnelles;
- Difficulté expérimentale;
- Coût.
Quels sont les systèmes possibles pouvant être utilisés pour permettre l’expression de protéines recombinantes? (6)
- Bactéries : E. coli;
- Levures : S. cerevisiae;
- Cellules d’insectes/Baculovirus;
- Système de reticulocytes: transcription/traduction in vitro;
- Cellules de Mammifère en culture;
- Animaux transgéniques (mouches, souris etc….).
Quels sont les buts possibles des expériences in vitro? (5)
- Réaction enzymatique;
- Interactions protéiques;
- Étude de structure;
- Génération d’antigènes;
- Production de ligand.
Quels sont les buts possibles des expériences in vivo? (5)
- Fonction biologique;
- Interactions protéiques;
- Activation enzymatique;
- Phosphorylation;
- Régulation de l’expression.
Quel est le système d’expression qui est favorisé en laboratoire? Quels sont les effets positifs/négatifs de celui-ci?
Les bactéries sont favorisées.
- Positif: utilisation facile, coûts bas, grand rendements.
- Négatif: aucunes modifications post-traductionnelles possibles.
Quel est le système d’expression qui n’est pas favorisé en laboratoire? Quels sont les effets positifs/négatifs de celui-ci?
Les cellules de mammifères ne sont pas favorisées.
- Positif: modifications post-traductionnelles possibles, permet la production de protéines seulement formées par mammifères.
- Négatif: utilisation difficile, coûts élevés, bas rendements.
Vrai ou faux? Le choix de l’organisme est dédié en fonction du but expérimental.
Vrai.
Les bactéries/levures sont surtout pour produire grandes quantités de protéines pour expériences in vitro (qui ne sont pas modifiées post-traductionnellement).
Les cellules de mammifères sont surtout pour valider des résultats, surtout pour l’étude des protéines.
Vrai ou faux? Il est impossible pour une bactérie d’entreprendre des modifications post-traductionnelles.
Faux. Il fut récemment découvert que la bactérie est en mesure de phosphoryler/glycosyler à faible échelle.
Vrai ou faux? Le choix du vecteur dépend de l’organisme dans lequel la protéine sera exprimée.
Vrai. La séquence promotrice permettant d’induire la transcription de l’ADN complémentaire inséré dans le vecteur en ARNs messagers est spécifique à l’organisme-hôte.
Qu’est-ce que les vecteurs incorporent afin de permettre la purification ou l’isolation subséquente des protéines produites? (2)
- Différents promoteurs (plus ou moins forts);
- Différentes étiquettes.
Quels sont les facteurs importants présentés sur un vecteur de réplication? (3)
- Polylinker, site de clonage;
- Marqueur de sélection;
- Origine de réplication.
Dans l’exemple de pET-28a, quelle est la fonction du domaine rbs?
Permet au ribosome E.coli de se lier et commencer la traduction des protéines.
Vrai ou faux? Dans l’exemple de pET-28a, le promoteur utilisé est celui de E.coli.
Faux, le promoteur utilisé est le T7 promoteur primer, puisqu’il est plus stable et précis.
Dans un système pET/BL21(DE3), qu’est-ce que l’expression inductible?
C’est le fait que l’opérons peut être régulé par un facteur externe, tel que l’IPTG.
Dans le système pET, pourquoi est-ce nécessaire d’utiliser des souches bactériennes BL21(DE3)?
Parce que sinon, la transcription de l’ARN polymérase sera faible, et la stimulation sera moindre.
Qu’est-ce que le gène represseur lac (lacI)?
Facteur de répression qui se lie étroitement à l’opérateur.
Qu’est-ce que l’arabinose?
Sucre monosaccharidique métabolisé dans les bactéries.
Lorsque l’arabinose est absente, qu’arrive-t-il? La transcription est permise ou empêchée?
Le complexe O2 - I1 est formé, ce qui empêche la transcription. L’ARN polymérase ne peut pas se lier à cause de la boucle 1-2.
Lorsque l’arabinose est présente, qu’arrive-t-il? La transcription est permise ou empêchée?
Le complexe I1 - I2 est formé, ce qui permet la transcription. L’ARN polymérase peut se lier, puisque la boucle 2-3 est formée.
Qu’est-ce que la protéine CAP et quel est son rôle dans la transcription en relation avec l’AMPc?
La protéine CAP soutient la transcription. Lors de la présence d’AMPc, cette dernière se lie à la CAP pour augmenter la stimulation.
Quel est l’effet de la concentration de glucose sur la concentration d’AMPc?
Plus le glucose augmente, plus l’AMPc diminue.
Le promoteur T7lac est souvent retrouvé dans quel vecteur?
Dans les vecteurs pET.
Le promoteur araBAD est souvent retrouvé dans quel vecteur?
Dans les vecteurs pBAD.
Qu’est-ce que l’élément TRE, et quel est son rôle dans l’expression de la tetracycline?
Un TRE (trans-regulatory element) est composé de 7 tetO (tetracycline operator).
Il est considéré comme étant “l’élément réponse”.
Lorsqu’il y a le tTA lié au TRE en absence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?
tTA: tetracycline-controlled transactivator.
La transcription à lieu.
Lorsqu’il y a le tTA lié au TRE en présence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?
La transcription n’a pas lieu, car tet se lie à tTA, empêchant ainsi à tTA de se lier à TRE.
Quelle est la composition de tTA? (2)
- tetR : répresseur tet;
- VP16.
Lorsqu’il y a la présence de rtTA en absence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?
rtTA: reverse tTA.
L’absence de tet empêche le rtTA de se lier au TRE, ce qui bloque la transcription.
Lorsqu’il y a la présence de rtTA en présence de tetracycline, qu’arrive-t-il à la transcription?
La présence de tet permet de former un complexe tet-rtTA, ce qui permet la fixation de TRE, et donc permet la transcription.
Quelle est la composition de rtTA? (2)
- tetR mutant;
- VP16.
Qu’est-ce que le VP16?
Virion protein 16.
Source : https://www.addgene.org/col lections/tetracycline/
Qu’est-ce que la doxycycline et quelle est sa différence comparément à la tétracycline?
La doxycycline permet de voir une voie alternative à la tetracycline.
La différence est le placement d’un groupement hydroxy sur la molécule (tet = 2ieme ring, dox = 3ieme ring).
Qu’est-ce que l’induction positive? Donne un exemple.
L’addition d’un inducteur permet la liaison du complexe inducteur-activateur à l’opéron (où l’activateur n’était pas initialement attaché à l’opéron), ce qui permet la transcription.
Exemple: tetracycline on.
Qu’est-ce que l’induction négative? Donne un exemple.
L’addition d’un inducteur permet le détachement du complexe inducteur-répresseur de l’opéron (où le répresseur était initialement lié à l’opéron) ce qui permet la transcription.
Exemple: IPTG dans l’opéron lac.
Qu’est-ce que la répression positive? Donne un exemple.
L’addition d’un répresseur forme le complexe activateur-répresseur, ce qui détache le complexe de l’opéron (où l’activateur était initialement attaché à l’opéron), ce qui empêche la transcription.
Example: tetracycline off.
Qu’est-ce que la répression négative? Donne un exemple.
L’addition d’un corépresseur forme le complexe répresseur-corépresseur, ce qui permet son attachement à l’opéron (le répresseur n’étant pas initialement attaché à l’opéron), ce qui empêche la transcription.
Example: opéron trp.
Vrai ou faux? Les différentes souches d’E.coli pour soit le clonage, soit l’expression sont facilement interchangeables.
Faux. Il est rarement possible d’interchanger les souches d’E.coli entre clonage et expression, puisque les buts scientifiques sont différents.
Quelles sont des modifications standards pouvant être faites aux souches d’E.coli? (4)
- ompT: élimine une protéase de la membrane externe;
- Ion protease: élimine la protéase;
- hsdSB: pas de système de méthylation/restriction;
- dcm: pas de cytosines méthylées.
Il y a aussi la possibilité d’avoir des problèmes spécifiques concernant l’expression de protéines dans les souches d’E.coli. Quelles sont des solutions possibles? (2)
- Modification de l’environnement de repliement des protéines (l’environnement redox, ou la co-expression avec un facteur nécessaire, par exemple un chaperon ou une kinase);
- L’utilisation des codons de E. coli par rapport à celle du gène étudié (ARNt supplémentaires, ou gène synthétique).
Quelle est la souche bactérienne d’E.coli la plus souvent utilisée?
DE3.
Quels sont les points clés pour le clonage dans un vecteur? (4)
- Importance du sens de clonage;
- Bactérie ne fait pas d’épissage;
- Ajout d’une étiquette en N-terminal de la protéine à exprimer (5’ du cDNA);
- Ajout d’une étiquette en C-terminal de la protéine à exprimer (3’ du cDNA).
Quels sont les éléments clés du sens de clonage? (3)
- Promoteur;
- ATG;
- Codon stop (TGA, TAA, TAG).
Concernant le fait que la bactérie ne fait pas d’épissage, comment est-ce que cela impacte la séquence de l’insert?
L’insert est l’ADNc obtenu à partir d’un ARNm mature, donc est dépourvu d’introns.
Quels sont les éléments à prendre en considération lors de l’ajout de l’étiquette en 5’ du cDNA? (2)
- Nécessite une clonage « en phase » (l’ORF de l’étiquette doit être en phase avec l’ORF du cDNA);
- L’ATG utilisé est celui de l’étiquette (présent sur le plasmide) pour la traduction de la protéine de fusion.
Il faut faire attention de ne pas introduire quoi entre l’étiquette et le cDNA lors du clonage?
Un codon STOP.
Quels sont les éléments à prendre en considération lors de l’ajout de l’étiquette en 3’ du cDNA? (3)
- Le STOP du cDNA ne doit pas être conservé dans l’insert;
- Le STOP utilisé sera celui après l’étiquette disponible sur le plasmide;
- L’ATG utilisé sera celui du cDNA.
Vrai ou faux? Le moment de l’induction de la bactérie est aléatoire.
Vrai. Il faut choisir le moment de l’induction en fonction de la bactérie utilisée.
Vrai ou faux? Les cellules meurent rapidement à cause de leur faible taux de croissance et leur synthèse très faible de protéines recombinantes.
Faux. Les cellules meurent rapidement à cause de leur fort taux de croissance et leur synthèse très importante de protéines recombinantes.
Quel est l’impact de la mort cellulaire sur l’expression des protéines recombinantes?
Cela limite l’expression des protéines recombinantes.
Quelle est la solution à prendre pour limiter la mort des cellules exprimant les protéines recombinantes?
Faire un découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d’intérêt) et une phase d’expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine).
À quoi servent les biréacteurs en production industrielle?
Permettent le contrôle de température et oxygénation des cultures.
Vrai ou faux? Les vecteurs d’expression permettent seulement de produire des protéines in vivo.
Faux, la production in vitro est possible.
Un certain promoteur est très important dans les vecteurs d’expression in vitro. Lequel est-il?
Promoteur T7.
Présence du promoteur T7 dans le plasmide, ainsi que l’utilisation de l’ARN polymérase T7.
Quel est le but d’utiliser des étiquettes et protéines de fusion?
Afin de faciliter la purification et l’analyse de protéines.
La poly-His (6X) permet de faire quoi, en terme de purification par affinité?
La purification permet de former un complexe d’interactions entre les groupements azotés et le nickel.
Elution par l’imidazole, EDTA ou faible pH.
La strep-tag II permet de faire quoi, en terme de purification par affinité?
Strep-tactin est lié à la résine. Strep-tag II (attaché à une protéine recombinante) se lie à strep-tactin.
Elution par desthiobiotine permet le relâchement du complexe strep-tag II / protéine recombinante.
Quelles sont les étapes de la purification de protéines par fusion GST? (3)
1) Production de la protéine (lisant bactérien);
2) Ajout de billes de sépharose couplées au glutathion;
3) Élution de la protéine avec le glutathion.
Que fait le complexe GST sur la protéine en présence de gluthathion?
Les billes de sépharose présentent des molécules de glutathion, ce qui permet au complexe GST de s’y lier.
Vrai ou faux? Les lavages permettent d’éliminer toutes autres protéines non liées au glutathion.
Vrai.
Le GST lie quelle partie du glutathione?
La partie réduite du glutathione est liée au GST.
Quels sont les deux types de gels dans l’électrophorèse SDS-PAGE?
- Entassement (stacking);
- Séparation (running).
Quelle est la fonction du gel d’entassement?
Sert à la concentration des protéines de l’échantillon de façon à ce qu’elles entrent toutes en même temps dans le gel de séparation.
Quelle est la fonction du gel de séparation?
Permet la séparation des protéines selon leur poids moléculaire, les plus grosses migrant le moins rapidement.
Vrai ou faux? Le gel d’entassement est plus basique que le gel de séparation.
Faux. Le gel d’entassement a un pH de 6.8, tandis que le gel de séparation a un pH de 8.8.
Dans le gel, quelle est la fonction du bis-acrylamide?
Agit comme agent pontant.
Quels sont les deux éléments du gel, et que constituent-ils?
Acrylamide et bis-acrylamide.
Constituent le réseau de mailles à travers lequel les protéines devront passer.
Quel élément initie la polymérisation?
L’APS (ammonium persulfate).
Quel élément permet de catalyser la réaction?
Le TEMED.
Quelle est la fonction du tampon de Laemmli?
Permet la dénaturation des protéines afin de permettre la migration selon la masse moléculaire.
De quoi est composé le tampon d’échantillon de Laemmli? (5)
- SDS 2%;
- β-mercaptoéthanol ou DTT 100 mM;
- Glycerol 10%;
- Bleu de bromophénol 0,01%;
- 62,5 mM Tris-HCL pH 6,8.
À quoi sert le SDS dans le tampon Laemmli? (2)
- Dénaturer les protéines;
- Charger les protéines négativement: masque la charge intrinsèque des protéines. Le ratio charge/masse est identique pour toutes les protéines.
À quoi sert le β-mercaptoéthanol dans le tampon Laemmli?
Dissociation des ponts disulfures.
À quoi sert le glycérol 10% dans le tampon Laemmli?
Augmente la densité (donc alourdit) les échantillons, ce qui facilite la migration.
À quoi sert le bleu de bromophénol 0.01% dans le tampon Laemmli?
Visualisation des protéines lors du dépôt et le front de migration.
Après avoir placé l’échantillon dans le tampon, que faut-il faire? À quoi est-ce que cela sert?
Il faut faire chauffer le tout à 95°C pendant 5 minutes.
Cela sert à la dénaturation des protéines.
Puisque l’électrophorèse passe de négatif à positif, cela permet de faire la migration de quel type de protéines?
Permet la migration de protéines négatives.
hinhin question piège
Vrai ou faux? Lorsque l’échantillon présente des protéines de petites tailles, il est préférable d’utiliser un gel de basse concentration.
Faux. Il est préférable d’utiliser un gel de plus haute concentration, vu que cela permet de faire un plus grand retardement protéique.
Si les grosses protéines sont bien séparées dans un gel moins concentré, qu’arrivera-t-il aux protéines miniatures?
Elles seront perdues (sorties du gel avec le front de migration).
À quoi sert la coloration du gel avec le bleu de Coomassie?
Cette coloration non-spécifique permet de lier Coomassie G-250 aux acides aminés chargés positivement et aux chaînes latérales aromatiques.
Vrai ou faux? Il n’existe seulement le bleu de Coomassie pour faire la coloration non-spécifique.
Faux. Il y a plusieurs autres méthodes de coloration non-spécifiques.
Dans les laboratoires, il faut faire attention de ne pas dénaturer la protéine. Quelles sont deux techniques permettant l’extraction par destruction mécanique? Quelle précaution faut-il prendre?
- Sonicateur;
- Rupture de cellules par pression.
Il faut faire le tout sur glace, car l’utilisation de ces machine génère beaucoup de chaleur.
Quelle est la méthode d’extraction protéique la plus importante?
Par lyse cellulaire.
Quels sont les types de détergents utilisés pour lyse cellulaire? (2) Comment fonctionnent-ils?
- Les détergents ionique sont dénaturants. Ils dissocient les interactions protéine-protéine. Ils ont une très bonne capacité à solubiliser les protéines membranaires;
- Les détergents non-ioniques brisent les interactions lipide-lipide et lipide-protéine, mais sont non-dénaturants. Ils permettent l’étude des interactions protéine-protéine qui ne sont pas détruites en leur présence. Les protéines isolées maintiennent leur structure native ainsi que leurs fonctions (enzymatiques ou non).
Donne un exemple d’un détergent ionique.
SDS.
Donne un exemple d’un détergent non-ionique.
Triton X-100.
Pourquoi faut-il faire la lyse sur glace?
Afin de protéger les protéines de la dégradation, car la lyse active les protéases. On utilise aussi des inhibiteurs de protéases dans le tampon de lyse.
Si un détergent est très ionique, quel sera l’impact sur la protéine?
Il aura une plus grande capacité de solubiliser les protéines, ce qui veut donc dire qu’il aura tendance à les dénaturer.
