Cours 1 Flashcards
Qu’est-ce qu’une multiplication à l’identique en biologie?
C’est une conservation parfaite de l’information génétique.
Quels sont les deux types de clonage?
- Clonage cellulaire (échelle cellulaire)
- Clonage reproductif (échelle de l’organisme entier).
Comment se fait l’amplification d’un fragment d’ADN?
Par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur.
Qu’est-ce que le clonage en biotechnologie?
- C’est une technologie de l’ADN recombinant.
Qu’est-ce que la technologie de l’ADN recombinant/génie génétique?
Ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.
Qu’est-ce que l’ADN recombinant?
C’est une combinaison entre l’ADN d’un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut venir d’une espèce totalement différente).
Que peuvent exprimer les cellules modifiées ayant intégré un ADN recombinant?
Une protéine recombinante, par exemple d’une espèce différente ou une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette).
Quel est l’objectif principal de la technologie de l’ADN recombinant?
Isoler et amplifier à l’identique une séquence d’ADN d’intérêt.
Donnez les applications de la technologie d’ADN recombinant. (3)
- Analyser l’ADN génomique, le séquençage de l’ADN
- Analyser la structure et l’expression d’ARNm
- Expression des protéines recombinantes (bactéries, système, modèle animal)
Donnez les 5 trucs qu’on peut faire l’expression des protéines recombinantes.
- Étudier la fonction et la signalisation des protéines.
- Étudier les intéractions prot-prot
- Déterminer la structure des protéines
- Produire des Ag pour générer des Ac
- Générer des vaccins et médicaments recombinants.
Donnez 3 exemple d’utilisation de technologie d’ADN recombinant.
- Synthèse d’insuline humaine par génie génétique
- Plantes transgéniques
- ndc p17
Quelles techniques permettent de modifier l’environnement génétique des organismes?
Un nombre restreint de techniques inspirées de l’étude de l’ADN, l’ARN, des bactéries et des virus.
Quels sont les principes de base de l’ADN recombinant? (3)
- L’enzymologie des acides nucléiques,
- la complémentarité des bases
- la possibilité d’introduire de l’ADN dans des organismes.
Donnez les outils du clonage. (4)
1- vecteurs de clonage
2- cellules hôtes
3- enzymes pour manipuler l’ADN
4- techniques reliées au clonage et à l’analyse
Qu’est-ce qu’un vecteur en biologie moléculaire? Comment appelle-t-on l’ADN inséré dans un vecteur?
- C’est l’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier.
- Insert, ADN étranger ou ADN exogène.
Quels types d’ADN sont généralement utilisés comme vecteurs?
Des plasmides ou des bactériophages.
Donnez la définition d’un vecteur de clonage.
Une séquence d’ADN permettant la propagation, la sélection et la modification d’une séquence d’ADN d’intérêt.
Qu’est-ce qu’un plasmide et leur taille maximale?
- Un petit fragment d’ADN circulaire présent dans la cellule bactérienne, indépendant du génome bactérien.
- Environ 10 kb.
Comment se répliquent les plasmides?
De façon autonome dans un organisme.
Qu’est-ce qu’un phage et quelle est la taille des phages utilisés comme vecteurs?
- Virus qui infectent des bactéries.
- Entre 25 et 100 kb.
Quel est un exemple de bactériophage modifié et sa particularité?
- Le bactériophage M13.
- Possède un génome ADN simple brin. (après infection, synthèse de brin complémentaire ⮕ se comporte comme plasmide dans bactérie)
Qu’est-ce qu’un cosmide et leur taille d’insertion possible?
- Un vecteur artificiel constitué d’un plasmide hybride contenant la séquence cos du phage lambda.
- Jusqu’à environ 45 kb.
Quelle est la particularité des cosmides?
Combine les avantages de clonage plasmides et augmente la taille d’insertion possible dans les phages lambda.
Quels sont d’autres types de vecteurs de clonage et leur taille (plus petit au plus grand)?
- BAC (chromosome bactérien artificiel ; 300 kb)
- YAC (chromosome de levure artificiel ; 1000 kb)
- HAC (chromosome humain artificiel ; 6-10 Mb)
Vrai ou Faux.
L’ADN étranger/d’intérêt prend la place des éléments non essentiels dans le vecteur.
Vrai.
seulement l’ADN nécessaire à la réplication/répartition/stabilité cellulaire est gardé dans le vecteur.
Quels sont les composants principaux d’un cosmide?
Des extrémités cohésives et un plasmide.
Quels sont les éléments distinctifs du BAC?
- F plasmide (facteur de fertilité)
- Conjugaison (transfert de gènes entre bactéries)
- gènes par pour répartir l’ADN entre cellule filles.
Comment choisit-on les vecteurs?
Selon la taille et les besoins de recherche.
Classez les vecteurs de clonage (3) selon le nombre qu’il faudrait utiliser pour un étude du génome humain. (plus grand au plus petit).
plasmide > cosmide > BAC
Donnez la définition d’une cellule hôte.
Cellule hébergeant un matériel génétique étranger apporté par un virus, un plasmide, un ADN recombiné in vitro, ou une cellule entière.
Donnez les catégories de cellules hôtes et un exemple. (4)
- bactérie (E.coli)
- levure (S. cerevisae)
- cellules de mammifères (chinese hamster ovary CHO)
- cellules d’insectes
Quels sont les avantages des bactéries comme cellules hôtes?
- Nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisable
- Culture en masse dans les fermenteurs et taux d’expression élevés.
Quels sont les inconvénients des bactéries comme cellules hôtes?
- secrètent mal les protéines:
- éclatement de bactéries
- pas de modifications post-traductionnelles.
Quels sont les avantages des levures comme cellules hôtes?
Elles permettent des modifications post-traductionnelles.
Quels sont les inconvénients des levures comme cellules hôtes?
La sécrétion des protéines est difficile et le rendement est moins bon.
Quels sont les avantages des cellules de mammifères comme cellules hôtes?
- Culture de masse en bioréacteurs
- production de protéines complexes.
Quels sont les inconvénients des cellules de mammifères comme cellules hôtes?
Elles sont chères et ont un rendement plus faible.
Quel rôle jouent les bactéries dans l’amplification de l’ADN?
Elles permettent l’amplification à l’identique de séquences d’ADN sous forme de plasmide.
Donnez les enzymes qui servent à copier. (2)
- ADN polymérase
- ARN polymérase
Donnez les enzymes qui servent à couper. (5)
- 5’→3’ exonucléase
- 3’→5’ exonucléase
- endonucléase
- topoisomérase
- recombinase
Donnez les enzymes qui servent à coller. (4)
- ADN ligase
- ARN ligase
- topoisomérase
- recombinase
Donnez les enzymes qui servent à modifier. (3)
- phosphatase
- phosphokinase
- terminal tranferase
Vrai ou Faux.
Les polymérase colle de 3’→5’.
FAUX.
L’ADN polymérase et l’ARN polymérase colle de 5’→3’.
Quelles sont les techniques reliées au clonage et à l’analyse? (8)
- Extraction et quantification d’ADN,
- PCR pour amplifier et modifier gène d’intérêt
- construction et modification d’un vecteur,
- transformation pour insérer plasmid dans e.coli
- gel d’agarose pour analyser fragment ADN
- carte de restriction d’un plasmide
- séquençage d’ADN,
- hybridation (Northern Blot)
Donnez la “formule” pour le clonage d’ADN dans un plasmide/vecteur.
vecteur/plasmide + ADN/gène d’intérêt, ou insert + enzymes = plasmide recombinant.
Quels sont les composantes d’un vecteur ou plasmide dans le clonage d’ADN?
- Marqueur de sélection
- Origine de réplication
- Polylinker, site de clonage.
Qu’est-ce qu’un marqueur de sélection?
gène qui codent pour la résistance aux antibiotiques.
Quel est le rôle de l’origine de réplication dans un plasmide?
séquence pour commencer la réplication plasmidique.
Qu’est-ce qu’un polylinker/site de clonage ?
site de restriction où on coupe et insère le gène d’intérêt.
Qu’est-ce qu’un plasmide recombinant?
Un plasmide qui contient un gène d’intérêt inséré.
Quels sont les moyens d’obtenir de l’ADN à cloner? (4)
- À partir de l’ADN génomique,
- d’un autre plasmide ou vecteur,
- par amplification (PCR)
- par synthèse d’acides nucléiques (synthèse in silico) de séquence connue.
Dans quel cas on utilise la PCR?
lorsque la quantité de matériel est limitée ou pour obtenir un fragment spécifique.
Quelle est la première étape dans le clonage?
DIGESTION - LIGATION.
aka on fait l’ADN recombinant avec le plasmide et l’insert.
Quelle est la deuxième étape après la digestion et la ligation?
TRANSFORMATION, SÉLECTION ET AMPLIFICATION:
on met les bactéries dans un agar qui contient des antibiotiques pour garder que celles qui ont le plasmide et qui peuvent croitre.
Quelle étape suit la transformation dans le processus d’ADN recombinant?
PURIFICATION DE L’ADN RECOMBINANT:
inocule les bactéries dans un bouillon avec antibiotiques, donc on augmente le nb de bactéries avec ADN recombinant.
Quelle est la dernière étape du processus d’ADN recombinant?
ANALYSE:
on vérifie le clonage avec le séquençage.
La structure de l’ADN polymérase ressemble à …
une main droite.
Quelles sont les trois activités de l’ADN polymérase?
- Polymérase 5’ à 3’,
- Exonucléase 3’ à 5’,
- Exonucléase 5’ à 3’.
Quel est le rôle du site actif de la polymérase?
Il permet la copie de l’ADN matrice et l’ajout de l’amorce (nouvel ADN).
Quel terme est utilisé pour décrire la modification d’une séquence d’ADN?
Édition.
l’exonucléase corrige les erreurs.
Quel est le rôle de l’ADN polymérase?
Catalyse la synthèse d’un nouveau brin complémentaire à partir d’une matrice d’ADN simple brin et de dNTPs.
Comment se produit l’attaque nucléophile lors de la synthèse de l’ADN?
Le 3′- OH naissant attaque l’a-phosphate du dNTP entrant.
Dans quel sens l’ADN est-il synthétisé?
Dans le sens 5′ à 3′.
Vrai ou Faux.
Le mécanisme catalytique de l’ADN polymérase dépend de 2 Mg2+.
Vrai.
(a et b)
Quel est le rôle du métal A dans le mécanisme catalytique?
- Établir un pont entre le 3’ OH et le PO4 2- et activer le 3’ OH.
- Active le 3’ OH.
Quel est le rôle du métal B dans le mécanisme catalytique?
- Orienter le dNTP lié,
- Protéger les charges négatives de dNTP
- Stabiliser l’état de transition.
À quoi sert le ddCTP dans le mécanisme de synthèse?
L’ajout de ce nucléotide va arrêter la synthèse parce qu’il n’y a plus de OH à combiner.
Quels sont les rôles de l’ADN polymérase en termes d’exonucléase 3’ → 5’? (2)
- Hydrolyse la liaison entre O3’ et P pour laisser un 3’ - OH à l’extrémité du brin d’ADN.
- Révision des erreurs de polymérase.
Quels sont les rôles de l’ADN polymérase en tant qu’exonucléase 5’→3’?
- Hydrolyse la liaison entre O3′ et P pour laisser un 3′ - OH à l’extrémité.
- Supprime un nucléotide à la fois de l’extrémité 5’.
- Déplacement du site de coupure (simple brin) → synthèse de brin retardé de l’ADN → réparation de l’ADN.
