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Travaux pratiques 2 > Cours 4 > Flashcards

Cours 4 Flashcards

1
Q

Quel élément est nécessaire pour amplifier un vecteur sans insert?

A

Une souche résistante au gène toxique.

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2
Q

Quels composés du vecteur bloque la traduction des gènes? (2)

A

Le peptide ou ARNt.

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3
Q

Quels sont les choix possibles pour la lyse membranaire de la cellule? (4)

A

1) Mécanique;
2) Détergent (SDS);
3) Lysozyme;
4) Lyse alcaline.

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4
Q

Quels sont les choix possibles pour la séparation de l’ADN plasmidique des protéines et de l’ADN chromosomal? (3)

A

1) Neutralisation pH (ségrégation par conformation);
2) Extraction au phénol, précipitation à l’éthanol;
3) Méthodes utilisant des billes de silice.

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5
Q

Vrai ou faux? Même si le mélange est fortement agité, l’ADN plasmidique et l’ADN chromosomal ne vont jamais se retrouver au même niveau dans le tube.

A

Faux. Lors de la précipitation, il ne faut pas trop agiter le tube, afin de s’assurer de ne pas détruire la structure de l’ADN chromosomal.

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6
Q

Quelles sont les étapes de préparation d’ADN plasmidique? (3)

A

1) Lyse de membrane;
2) Neutralisation du pH et précipitation des lipides / grosses protéines;
3) Précipitation cause la séparation entre le plasmide et l’ADN chromosomal.

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7
Q

Quels sont des exemples de gènes d’intérêt?

A
  • Enzyme de restriction;
  • ADN ligase;
  • Gène synthétique;
  • Gibson assembly;
  • Golden Gate assembly;
  • Clonage de Gateway;
  • Sequence and ligation independent cloning.
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8
Q

Brièvement, quel est le processus d’insertion d’un gène d’intérêt?

A

1) Le gène d’intérêt est sélectionné sur son plasmide et amplifié (via PCR);
2) Le gène d’intérêt est digéré (EcoRI et NotI sont rapetissés);
3) Le gène d’intérêt est ajouté au vecteur, auquel une digestion a été entreprise dans le but « d’ouvrir » une partie.
4) Le gène d’intérêt est ajouté au vecteur.

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9
Q

Vrai ou faux? La purification de l’ADN n’est pas nécessaire lors d’une transformation génomique.

A

Faux, il faut absolument purifier l’ADN.

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10
Q

Avant de permettre à la ligase d’agir sur les brins d’ADN, quel processus doit être entreprit?

A

Digestion et purification (gel d’agarose, silice).

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11
Q

Quel est le nombre de nucléotides nécessaires sur EcoRI et NotI pour faire la transformation?

A

20 à 30 nucléotides.

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12
Q

Selon le code de lecture, est-ce possible de lire un codon stop?

A

Oui, c’est possible de lire un codon stop. Si le cadre de lecture est déplacé d’un nucléotide, il est possible que les codons diffèrent.

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13
Q

Plusieurs cadres de lectures (enzymes de restriction) peuvent être utilisées comme amorces pour l’insertion du gène d’intérêt. Comment choisit-on lequel prendre?

A

EcoRI permet l’insertion du gène d’intérêt en respectant la transcription du codon start. SalI modifie le cadre de lecture, ce qui modifie la transcription du codon start. Si nous voulions utiliser SalI, il faudrait ajouter deux nucléotides, ce qui permettrait au codon start d’être bien lu.

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14
Q

Qu’a-t-il de spécial chez l’enzyme de restriction NdeI ?

A

Elle contient déjà le codon start dans son cadre de lecture.

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15
Q

Vrai ou faux? Il est possible d’effacer un codon complètement, afin de permettre à la traduction de continuer.

A

Vrai. Dans l’enzyme de restriction NotI, le codon stop peut être effacé, ce qui permet son utilisation.

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16
Q

Lors de la transformation de petit ADN, qu’est-il nécessaire sur l’extrémité 5’ ?

A

Un phosphate 5’ est nécessaire.

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17
Q

Qu’est-ce que la méthode d’assemblage Golden Gate?

A

Cette méthode d’assemblage utilise des endonucléases de type II qui coupent à l’extérieur de la séquence de reconnaissance.

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18
Q

Pourquoi est-ce que la ligase est nécessaire dans le processus de Golden Gate?

A

La ligase est nécessaire, car le processus n’est pas assez stable pour faire toutes les étapes en même temps.

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19
Q

Qu’est-ce que le produit final de l’assemblage Golden Gate NE contient PAS? (2)

A

1) Pas de sites de restriction;
2) Pas de cicatrices de clonages.

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20
Q

Brièvement, quel est le processus de l’assemblage Golden Gate?

A

1) Endonucléase coupe vecteur et gène d’intérêt séparément, les deux au bout cohésif;
2) L’ajout se fait avec une ligase, sans la présence de sites Bsal.

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21
Q

Après l’action de la Bsal, qu’arrive-t-il entre le vecteur et l’insert de PCR?

A

L’assemblage a lieu, et la Bsal ne peut plus agir sur ce nouveau segment, puisque le site de reconnaissance n’est plus présent.

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22
Q

Qu’est-ce que le processus de ligation independent cloning (LIC)?

A

Ce processus créé de longues extrémités cohésives suffisamment stables pour être transformées sans ligature.

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23
Q

Qu’est-ce que cela veut dire lorsqu’un extrémité est transformée sans ligature?

A

Cela veut dire que les coupures sont fixées à l’intérieur de l’E.coli.

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24
Q

Quels sont les éléments nécessaires pour la LIC? (3)

A

1) ADN polymerase T4 (activité polymérase et exonucléase);
2) Séquence spécifique (pour amplification par PCR);
3) Vecteur préparé.

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25
Q

Vrai ou faux? Bsal coupe l’ADN sur le site de reconnaissance.

A

Faux, Bsal coupe en dehors de la séquence de reconnaissance.

26
Q

Brièvement, quel est le processus de LIC?

A

1) Bsal coupe le plasmide avant la séquence de reconnaissance;
2) L’exonucléase coupe le plasmide et l’insert (jusqu’à ce que l’enzyme se rend au nucléotide d’intérêt, exemple: présence de dGTP insinue que T4 arrête de couper lorsqu’elle rencontre un G);
3) Jonction des deux séquences complémentaires (14 paires de bases).

27
Q

Qu’est-ce qu’un RBS?

A

Ribosome binding site.

28
Q

Qu’est-ce que la TEV protéase? Quel est son mode d’action?

A

La TEV protéase est une enzyme qui coupe un segment protéique lorsqu’elle reconnait la séquence suivante : E-N-L-Y-F-Q (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln). Elle coupe après Gln.

29
Q

Les longues séquences de complémentarité utilisées par LIC sont générées par quelle enzyme?

A

Générées par T4 polymerase, et non par l’enzyme de restriction.

30
Q

Qu’est-ce que le processus de sequence and ligation independent cloning (SLIC)?

A

Ce processus utilise l’activité polymérase et exonucléase de l’ADN polymérase T4 (favorise exo 3’ - 5’).

31
Q

Vrai ou faux? L’action de la T4 peut être arrêtée par l’ajout d’un seul dNTP.

A

Vrai.

32
Q

Vrai ou faux? Il est nécessaire d’avoir des séquences spécifiques pour SLIC.

A

Faux. Les séquences ne nécessitent pas d’être spécifiques.

33
Q

Dans quel scénario les lacunes lors de SLIC sont-elles négligeables?

A

Les lacunes sont négligeables lorsque les régions d’hybridation sont relativement grandes.

34
Q

Brièvement, quel est le processus de SLIC?

A

1) Le produit PCR (gène d’intérêt) présente une séquence identique au vecteur;
2) La T4 polymerase agit vers 3’ de façon exo;
3) La T4 polymerase avec un dNTP agit sur les deux segments, ce qui les joint ensemble (overlap de 25 bases);
4) Les lacunes seront réparées dans E.coli via transformation.

35
Q

Qu’est-ce que le processus du Gibson Assembly?

A

Ce processus est indépendant des enzymes de restriction et des sites de restriction (comme SLIC/LIC). Son but est de produire des régions complémentaires entre l’insert et le vecteur par PCR.

36
Q

Quelles enzymes sont simultanément utilisées dans le Gibson Assembly? (3)

A

Ligase, exonucléase et polymérase.

37
Q

Brièvement, quel est le processus du Gibson Assembly?

A

1) L’exonucléase clive des parties des segments complémentaires, autant chez l’insert que chez le plasmide;
2) La polymerase et la ligase aident à la jonction entre les deux segments, ce qui créé un ADN circulaire entièrement duplex.

38
Q

Lors du Gibson Assembly, la PCR est entreprise sur quelle séquence: l’insert ou le vecteur?

A

La PCR est entreprise sur l’insert ET le vecteur. Cela permet donc aux deux séquences de se chevaucher, puisqu’elles sont complémentaires.

39
Q

Vrai ou faux? L’exonucléase est thermostable.

A

Faux. La polymerase et ligase sont thermostables, mais pas l’exonucléase.

40
Q

Quelle est la différence entre la polymerase T4 et l’exonucléase T5?

A

La T4 agit de 3’ vers 5’.
La T5 agit de 5’ vers 3’.

41
Q

Qu’arrive-t-il lorsque la T5 est inactivée?

A

La polymerase répare l’ADN lorsque la T5 est inactivée.

42
Q

Vrai ou faux? Les extrémités cohésives simple brin peuvent former des structures qui encouragent l’hybridation.

A

Faux. Ces structures bloquent l’hybridation.

43
Q

Quelle forme d’ADN est favorable pour l’hybridation? Quelles températures favorisent l’hybridation?

A

L’ADN simple brin et températures élevées.

44
Q

Vrai ou faux? Le Gibson Assembly permet l’assemblement de plusieurs fragments d’ADN en une seule réaction.

A

Vrai.

45
Q

Les régions de complémentarités du Gibson Assembly sont introduites par quel processus?

A

Par PCR.

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46
Q

Qu’est-ce que le clonage de Gateway (Invitrogen)?

A

Ce processus, qui est basé sur l’activité d’une recombinase, permet de facilement cloner de façon directionnelle un gène d’intérêt dans plusieurs vecteurs en utilisant la même stratégie.

47
Q

Quel est l’action de l’integrase dans Invitrogen?

A

Elle coupe et recombine l’ADN avec des séquences spécifiques.

48
Q

Invitrogen est basé sur quelle connaissance concernant l’ADN phage?

A

Le processus est basé sur comment un phage intègre son ADN dans l’ADN d’une bactérie.

49
Q

La serine recombinase permet de faire la transformation de brins. attB devient quoi? attP devient quoi?

A

attB ↔ attL
attP ↔ attR

50
Q

Pour faire le BP clonase, quelles enzymes/facteurs doivent être utilisés? (2)

A

1) INT (integrase);
2) IHF (integrase host factor).

51
Q

Pour faire le LR clonase, quelles enzymes/facteurs doivent être utilisés? (3)

A

1) INT (integrase);
2) IHF (integrase host factor);
3) Xis (excisionase).

52
Q

Dans Invitrogen, quel est le vecteur d’entrée?

A

attL.

53
Q

Dans Invitrogen, quel est le vecteur destination?

A

attR.

54
Q

Dans Invitrogen, quel est le vecteur d’expression?

A

attB.

55
Q

Dans Invitrogen, quel est le vecteur donneur?

A

attP.

56
Q

Qu’est-ce que la mutation ciblée par PCR (Quikchange)?

A

Processus qui permet de synthétiser ADN mutant à partir d’ADN matrice.

57
Q

Brièvement, quel est le processus de Quikchange?

A

1) Synthèse de brins d’ADN mutants (dénaturation de matrice, hybridation des amorces mutagènes, élongation des amorces pour copier plasmide);
2) Digestion de la matrice par DpnI (ADN matrice est méthylé et digéré par DpnI, ADN muté n’est pas méthylé, alors pas digéré);
3) Transformation de l’ADN muté en E.coli, et les cassures sont réparées.

58
Q

Quel est un avantage de Quikchange?

A

Permet de tester directement pour trouver la fonction protéique d’un gène.

59
Q

Est-ce que le processus de NEB est le même que celui du Quikchange?

A

Non, ils ne sont pas les mêmes.

60
Q

Brièvement, quel est le processus de NEB?

A

1) Amplification par PCR;
2) Traitement et enrichissement (kinase, ligase, DpnI);
3) Transformation sur gel.

61
Q

Quels sont les modifications possibles du génome lors de l’étape d’amplification par PCR lors du NEB? (3)

A

1) Substitutions;
2) Délétions;
3) Insertions.

62
Q

Lors de la deuxième étape du NEB (enrichissement), quelles sont les étapes? (3)

A

1) ADN linéaire est phosphorylé;
2) Ligase agit sur ADN phosphorylé et cyclise l’ADN;
3) DpnI digère le tout (afin d’éliminer la matrice).

Travaux pratiques 2 (8 decks)

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