Cours 6 - Mesure de l'activité enzymatique

Question 1

Quel est le rôle de l’activité enzymatique ?

Answer 1

Catalyse les réaction chimique en baissant l’énergie d’activation de cette réaction

Question 2

L’activité enzymatique est influencée à la fois par quoi? (2)

Answer 2

1- des propriétés spécifiques à l’enzyme
(concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs)

2-par des effets non spécifiques,
(des sels et tampons, pH, force ionique, température, et dans certain cas
d’autres protéines)

Question 3

Décrire la constante de Michaelis? (Km)

Answer 3

Km= concentrations de substrat qu’il faut pour arriver à vmax / 2 ~ valeur approximative de l’affinité du substrat pour l’enzyme
(concentration en substrat nécessaire pour saturer la moitié des sites catalytiques de l’enzyme).

La constante de Michaelis, ou Km, est une caractéristique très souvent utilisée en cinétique enzymatique pour décrire la réaction entre une enzyme et un substrat en particulier.

Cette constante correspond à la concentration, exprimée en mol/L (M), en substrat nécessaire pour atteindre la moitié de la vitesse maximale lors de la réaction.

Cela traduit donc la concentration en substrat nécessaire pour saturer la moitié des sites catalytiques de l’enzyme.

Le Km nous informe donc sur l’affinité entre l’enzyme et le substrat !

Question 4

Que signifie un Km élevé?

Answer 4

Ainsi, si le Km est élevé, de l’ordre du mM par exemple, cela signifie qu’une grande concentration de substrat est nécessaire pour atteindre la moitié de la vitesse maximale de réaction et donc, que l’enzyme possède une affinité relativement faible pour le substrat

Question 5

Que représente la constante k2 est souvent appelée kcat (constante catalytique)?

Answer 5

elle représente la constante de vitesse qui est égale au nombre de molécules de substrat transformées par chaque molécule d’enzyme par seconde (turnover number)

Question 6

Que demande la mesure de l’activité d’une enzyme?

Answer 6

En règle générale, la mesure de l’activité d’une enzyme demande des concentrations élevées de substrat qui sont parfois difficiles à atteindre

•Si l’enzyme obéit à la cinétique Michaelis-Menten, une concentration de substrat
dépassant 10 X le Km doit être utilisée (Figure 1A)
• À cette concentration de substrat, la vitesse mesurée représente 91% de la vitesse à concentration infinie; des complications apparaissent si une concentration faible de substrat est utilisée (Figure 1B)

Question 7

Complètez:

Considérant que toutes les déterminations de l’activité prennent un certain temps
à être complétées, il est important que la vitesse soit ______ pendant la période d’incubation utilisée pour détecter convenablement la ________ de la réaction

Answer 7

Considérant que toutes les déterminations de l’activité prennent un certain temps
à être complétées, il est important que la vitesse soit [linéaire] pendant la période d’incubation utilisée pour détecter convenablement la [formation du produit] de la réaction

Question 8

Quel est le rôles d’un inhibiteur d’une réaction enzymatique?

Answer 8

Les inhibiteurs permettent d’inactiver de manière réversible l’enzyme.

Question 9

Nommez et expliquez les 3 types d’inhibiteurs

Answer 9

• Les inhibiteurs compétitifs sont en compétition avec le substrat pour fixer le site actif de l’enzyme. Ils empêchent ainsi la liaison entre le substrat et l’enzyme. Toutefois, si le substrat se fixe à une enzyme, la réaction se fait normalement, aussi vite qu’en absence d’inhibiteur. Par conséquent, le Vmax (représentant la vitesse de la réaction) n’est pas modifié par la présence de l’inhibiteur. Le Km (représentant l’affinité entre le substrat et l’enzyme), quant à lui, augmente.
• Les inhibiteurs incompétitifs se lient au complexe Enzyme-Substrat (ES) mais pas à l’enzyme libre (E). Dans ce cas ils diminuent la vitesse de la réaction puisque les complexes ES sont inhibés. Toutefois, en bloquant la réaction, ils augmentent l’affinité apparente du substrat pour l’enzyme. Ainsi, le Vmax ainsi que le Km diminuent.
• Les inhibiteurs non-compétitifs se lient à l’enzyme libre ainsi qu’au complexe Enzyme- Substrat. Dans ce cas, la fixation entre le substrat et l’enzyme n’est pas affectée par la présence de l’inhibiteur. Toutefois, la vitesse de la réaction est diminuée. Ainsi, le Km reste le même et le Vmax diminue.

Question 10

V OU F?

S’il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par la réaction de retour (retro-inhibition).

Answer 10

VRAI

Question 11

Expliquez les 5 stratégies qui peuvent être utilisées pour démontrer:

S’ il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par la réaction de retour (retro-inhibition).

Answer 11

1. Mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de minimiser l’accumulation du produit
2. L’utilisation de hautes concentrations de substrat
3. Utiliser des pH non physiologiques (basiques si le produit de la réaction est un proton)
   pour enlever le proton et déplacer la réaction dans la direction de la formation du produit
4. L’utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit afin de minimiser sa concentration
5. l’inhibition par le substrat à des hautes concentrations peut aussi être due à la formation d’interactions non appropriées au site actif et qui mènent à l’inhibition de l’activité enzymatique

Question 12

Les valeurs de Vmax et Km sont influencé par 3 paramètres, lesquels?

Answer 12

Les valeurs de Vmax et KM sont influencées par le pH, la force ionique, et la température

Question 13

Expliquez l’influence du pH sur les valeurs de Vmax et Km

Answer 13

Le pH

• la valeur maximale de l’activité de certaines enzymes peut être très loin du pH physiologique
• par exemple, la phosphatase alcaline possède une activité maximale à pH 10-11.

Cependant, son KM est plus bas à pH 7 qu’à pH 10-11; ceci est important afin de comparer les activités entre les essais avec des conditions différentes

Question 14

Expliquez l’influence de la force ionique (tampon) sur les valeurs de Vmax et Km

Answer 14

Le tampon/force ionique

Certains tampons peuvent agir comme inhibiteurs

• Par exemple, le phosphate et certaines tampons anioniques, possédant des charges multiples tel que le citrate, compétitionnent avec des substrats possédant des charges négatives pour lier le site actif
• Puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et 100mM, même une association faible par le tampon peut provoquer une inhibition importante
• Des ions métalliques, essentiels pour l’activité, peuvent être complexés par des tampons tels que le citrate et l’imidazole, et compromettre l’activité enzymatique
• La force ionique physiologique se situe entre 0.1 - 0.2M; les enzymes sont très souvent moins actives à une force ionique inférieure à la valeur physiologique

Question 15

Expliquez l’influence de la température sur les valeurs de Vmax et Km

Answer 15

La température

• La vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 2 pour chaque
augmentation de 10C
• Cependant, à de hautes températures, même si la température augmente la vitesse d’une enzyme, l’enzyme peut être dénaturée durant l’essai

• Plus la période d’incubation est courte, plus la température apparente de l’activité maximale peut être élevée puisqu’il y a moins de temps pour que l’enzyme se dénature
• La température de référence et celle choisie est très souvent est 25C mais la température physiologique 37C est fréquemment utilisée

Question 16

Complètez:

La mesure de l’activité d’une enzyme dépend d’une méthode qui détermine la _________

Answer 16

La mesure de l’activité d’une enzyme dépend d’une méthode qui détermine la quantité de produit généré durant la réaction

Ceci peut impliquer la séparation du produit et du substrat après la réaction.

Question 17

Quelles méthodes peut-on faire pour démontrer :

La mesure de l’activité d’une enzyme dépend d’une méthode qui détermine la quantité de produit généré durant la réaction

Answer 17

méthodes discontinues(flot arrêté)

méthodes continues

Question 18

Expliquez les méthodes discontinues

Answer 18

Les méthodes discontinues:

• L’enzyme est incubé avec ses substrats pendant une certaine période de temps et la réaction est ensuite arrêtée
• Peuvent s’appliquer à n’importe quel système enzymatique
• Le produit est dosé et son évolution est assumée linéaire pendant la période de l’incubation

Question 19

Qu’est-ce qui faut vérifier lors de la mesure de l’activité d’une réaction enzymatique?

Answer 19

Une des premières choses à vérifier est l’évolution linéaire de la réaction

Procéder à une seule mesure peut sous-estimer la vitesse initiale du fait de la perte de linéarité
à des temps trop longs

Question 20

Pourquoi est-il essentiel de faire plusieurs incubations à des temps différents afin de vérifier si la réaction est linéaire?

Answer 20

Ceci est très important dans le cas d’extraits à partir d’une lyse cellulaire à cause de la possibilité de réactions secondaires:

• par exemple dans un extrait contenant l’enzyme subséquent dans une
  voie métabolique, une autre enzyme consomme le produit qu’on veut mesurer

Question 21

Donnez les conditions d’incubation

Answer 21

Il n’y a pas des contraintes véritables en ce qui concerne des conditions d’incubation

• l’échantillon contenant l’enzyme est ajusté à temps zéro et rapidement mélangé; la réaction est incubée pendant des temps fixe et ensuite arrêtée.
• la réaction est arrêtée par une méthode qui provoque la dénaturation instantanée de l’enzyme ou déplace l’équilibre de la réaction afin que l’enzyme ne soit plus active
• les méthodes souvent utilisées sont la précipitation par acide trichloracétique ou perchlorique ou par dénaturation thermique de l’enzyme
• on peut également utiliser le SDS pour dénaturer l’enzyme
• la réaction peut être arrêtée également par des méthodes non dénaturantes qui inactivent l’enzyme
• i.e. changement de pH, ajout d’EDTA si des ions métalliques sont essentiels, dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué par un isotope radioactif est mesuré

Question 22

Plusieurs produits de réactions enzymatiques peuvent être difficile à détecter

La mesure du produit par des méthodes enzymatiques est très souvent employée

Expliquez.

Answer 22

• une approche utilisée pour les détecter est de convertir le produit directement ou indirectement en un autre produit qui lui est plus facile à détecter
• les techniques de détection utilisées le plus fréquemment sont la spectrophotométrie ou la fluorométrie

Question 23

Quel est le but de ces méthodes? (spectroscopie et fluorométrie)

Answer 23

• le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de la production d’un chromatophore ou fluorophore important et qui est facile à détecter.

Question 24

Quelles sont les autres approche utilisées pour la mesure du produit? (2)

Answer 24

1- Détection indirecte : ajoute une enzyme qui utilise le produit de la réaction pour former du NADH par couplage avec une autre réaction.
(méthode par essais couplés)

2- Détection directe: un des produits de la réaction enzymatique absorbe la lumière, par exemple, la formation de NADH par
réduction de NAD+ (le NADH absorbe la lumière à 340 nm et émet de la fluorescence à 450 nm)

Question 25

V OU F?

Des techniques comme la chromatographie peuvent être utilisées afin de séparer les réactants (substrats et produits) avant qu’ils soient dosés.

Answer 25

VRAI

Question 26

En ce qui concerne la mesure de l’activité enzymatique, expliquez les méthodes continues

Answer 26

• les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observé
  pendant toute la réaction et généralement de façon instantanée
• il y a un nombre important d’enzymes dont l’activité peut être suivie directement grâce à la différence en absorbance ou fluorescence entre le produit et le substrat

Question 27

Les catégories d’enzymes dont ont peut mesurer l’activité en méthode continue sont: (3)

Answer 27

• les déshydrogénases qui utilisent NAD ou NADP,
• les hydrolases qui peuvent utiliser des substrats synthétiques qui libèrent des
  produits colorés ou fluorescents
• polymères endohydrolases qui par leur activité réduisent la viscosité d’un
  polymère

Question 28

Expliquez les méthodes couplées

Answer 28

Méthodes couplées

• le principe de la méthode couplée est comme celui de l’essai couplé où le produit qui ne peut pas être observé directement est transformé chimiquement ou enzymatiquement en un composé qui peut être observé
• mais en méthode continue, les réactants utilisés doivent fonctionner sous les conditions de la réaction enzymatique à mesurer
• dans la mesure de la vitesse de la réaction, la vitesse de transformation du produit par le système d’enzyme couplé ajouté doit être suffisante afin de suivre quantitativement la formation du produit
• une réponse linéaire par le système d’enzyme couplé assure le couplage quantitatif avec la formation du produit de l’enzyme d’intérêt
• réponse linéaire veut dire que l’activité mesurée par le système couplé augmente de façon proportionnelle avec la quantité d’enzyme utilisé dans l’essai