Cours 4 - (Ultra) Centrifugation Flashcards
Nommez les 2 types de centrifugations + sous-types
Centrifugations différentielles
Centrifugation préparative
-L'ultracentrifugation en
zones
-L'ultracentrifugation par
densité d'équilibre
Expliquez la sédimentation d’une molécule sphérique
Si le liquide a une densité do et la molécule a une densité de d
et si d > do la protéine volonté sédimente
Beaucoup d’expériences en biochimie exigent une ou plusieurs étapes de centrifugation. Expliquez le principe de cette méthode
Cette technique permet d’exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. On peut ainsi fractionner une préparation en un sédiment (ou “culot”), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.
Nommez et expliquez les 3 types de centrifugeuses
1- les centrifugeuses de table, utilisées notamment pour centrifuger des tubes Eppendorf de 1.5 mL
2- les centrifugeuses à haute vitesse, permettant la centrifugation jusqu’à 40,000 g pour des volumes allant jusqu’à 50 ou 100 mL
3- les ultracentrifugeuses permettant d’aller jusqu’à des vitesses de 100,000 g.
V OU F?
a- le comportement des macromolécules en solution, qui sont soumises au champ gravitationnel (facteur accélération g = 9.81 ms2), ne démontre aucune évidence de sédimentation
b- l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon hétérogène en solution
c- c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à de faibles accélérations qu’elles commencent à sédimenter.
d- L’ultracentrifugeuse fut inventée en 1923 par un chimiste suédois, Theodor Svedberg (prix Nobel de chimie 1926)
e- avec ce type de centrifugeuse, il est possible d’atteindre des vitesses de rotation de 150,000 rpm (révolutions par minute) qui donnent lieu à des forces dépassent 1,000,000 X g
f- Avec cette technique, Sverdberg a pu démontrer que les protéines sont des macromolécules de composition hétérogène et qu’un petit nombre de protéines sont composées de sous-unités.
a- VRAI
b- FAUX
l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon homogène en solution
c- FAUX
c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à des accélérations énormes qu’elles commencent à sédimenter.
d- VRAI
e- VRAI
f- FAUX
Avec cette technique, Sverdberg a pu démontrer que les protéines sont des macromolécules de composition homogène et qu’un grand nombre de protéines sont composées de sous-unités.
la vitesse avec laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de quoi?
Expliquez
sa masse
la force, Fsédimentation, subie par une particule de masse m est égale à la force centrifuge (mω2r) qui s’exerce sur la particule moins la force due
au déplacement de la solution par la particule (Vpρω2r ou force de flottaison)
Fsédimentation =
mω2r - Vpρω2
où : m est la masse de la particule w est la vitesse angulaire r est le rayon de gyration Vp est le volume de la particule ρ est la densité de la solution
En ce qui concerne la sédimentation, le déplacement d’une particule à travers une solution est opposée par quelle force ?
Cependant, le déplacement d’une particule à travers une solution est opposée par une force qui représente
la friction entre la particule et la solution
F friction = v f
où v est la vitesse de migration de la particule et f est le coefficient de friction
Expliquez la phase stationnaire
Sous l’influence d’une force centrifuge, une particule va accélérer jusqu’à ce que toutes les forces soient contrebalancées, soit :
mω2r - Vpρω2r = v f
où on atteint la phase stationnaire
À quoi peut servir la technique de sédimentation? Expliquez
À mesurer la masse de macromolécules
VOIR DIAPO POUR DÉMARCHE MATHÉMATIQUE
la masse des constituants de ces complexes est souvent exprimé en ______
Svedberg (S)
Ex. ribosome bactérien 30S et 50S…
Quelle est la 1ère étape dans la purification des protéines? pourquoi?
les dissoudre dans une phase liquide
- les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
- le plus souvent, leur libération ne demande que la lyse des cellules
Avant de concevoir un protocole pour lyser des cellules, vous devez choisir entre deux options lorsque vous utilisez un protocole / méthodes pour lyser des cellules, lesquelles?
- garder les protéines intactes (étudier la fonction des protéines)
- dénaturer les protéines (pour l’extraction d’ADN ou d’ARN)
Complètez:
En centrifugation différentielle, la séparation s’effectue principalement selon _______.
Ce type de séparation est couramment utilisé pour la récupération de _____ et l’obtention de ________.
Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut _______ afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de ______ se nomme ________.
Pendant la centrifugation d’un _______, les particules plus grosses _____ plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la base de l’obtention de ________ par centrifugation différentielle.
Un _______ de cellules peut être soumis à une série de forces g et de durées croissante afin de générer des ________.
En centrifugation différentielle, la séparation s’effectue principalement selon [la taille des particules].
Ce type de séparation est couramment utilisé pour la récupération de [culots] et l’obtention de [préparations partiellement pures d’organelles sub-cellulaires et de macromolécules.]
Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut [rompre les tissus ou les cellules] afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de [cellules fractionnées] se nomme [homogénat].
Pendant la centrifugation d’un [homogénat de cellules], les particules plus grosses [sédimentent] plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la base de [l’obtention de fractions d’organelles brutes] par centrifugation différentielle.
Un [homogénat] de cellules peut être soumis à une série de forces g et de durées croissante afin de générer des [culots d’organelles partiellement purifiées].
Quel est le principe de la centrifugation différentielle?
Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une première centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube.
Décrire la centrifugation préparative
- Les centrifugeuses préparatives sont conçues pour la préparation d’échantillons possédant des volumes significatifs
- La sédimentation peut être faite dans une solution inerte comme le saccharose
ou de chlorure de césium (CsCl) dans lesquels la concentration et donc la densité augmente du haut vers le bas du rotor - L’utilisation de gradients de densité augmente de façon significative le pouvoir de résolution de la centrifugeuse.
Nommez les 2 applications des gradients de densité (centrifugation préparative)
Les gradients de densité ont deux applications:
C - 1 Ultracentrifugation zonale ou en zones
C - 2 Ultracentrifugation en gradient de densité à l’équilibre
L’ultracentrifugation en zones sépare les particules par rapport à quoi?
selon leur coefficients de sédimentation
Expliquez le principe de l’ultracentrifugation en zones
Dans ce type de centrifugation, la solution de macromolécules est déposée sous forme de couche en haut d’un gradient de densité préparé au préalable
- On utilise le saccharose, qui est visqueux et biochimiquement inerte pour former le gradient
Puisque la vitesse de sédimentation est une fonction plus sensible à la forme d’une macromolécule qu’a sa densité, l’ultracentrifugation en zones sépare les macromolécules de forme similaire selon leur masse
- Pendant la centrifugation, chaque molécule se déplace à travers le gradient à une vitesse largement déterminée par leur coefficient de sédimentation et donc migre comme une zone
À la fin de l’expérience, la récolte des fractions se fait par l’insertion d’une aiguille au fond du tube de centrifugation et on collectionne le contenu du tube par un collecteur de fraction
L’ultracentifugation par densité d’équilibre est connue sous quel autre nom? et sépare les macromolécules selon quoi?
Cette méthode de centrifugation, aussi connue sous le nom de centrifugation isopycnique, sépare les macromolécules selon leur densité
Expliquez l’ultracentrifugation par densité d’équilibre
Dans ce type de séparation, une particule de densité spécifique sera entraînée vers le fond pendant la centrifugation jusqu’au point où la densité de la solution environnante est identique à celle de la particule. Une fois ce quasi- équilibre atteint, la durée de la centrifugation n’a aucune influence sur la migration de la particule.
V OU F?
En ce qui concerne l’ultracentrifugation par densité d’équilibre:
a- L’échantillon est dissout dans une solution concentrée d’une substance dense qui diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs2SO4, et qui est subie à des hautes vitesses de rotation
b- Le faible champ centrifuge génère un gradient important de sel dans lequel les
composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de densités égales à celle de la
solution de sel; autrement dit où (1- v/p) = 0 Donc une migration puisque v = 0.
c- La densité de la particule échantillon doit se trouver dans les limites des densités de gradient.
d- La durée de lot doit être assez courte pour permettre aux particules d’atteindre leur point isopycnique. Les petites durées de lot n’ont aucun effet indésirable.
a- VRAI
b- FAUX
Le fort champ centrifuge génère un gradient important de sel dans lequel les
composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de densités égales à celle de la
solution de sel; autrement dit où (1-v/p) = 0 Donc aucune migration puisque v = 0
c- VRAI
d- FAUX
La durée de lot doit être assez longue pour permettre aux particules d’atteindre leur point isopycnique. Les durées de lot excessives n’ont aucun effet indésirable.
Quelle technique est préférée pour la séparation des macromolécules qui possèdent une gamme de densités?
L’ultracentrifugation par densité d’équilibre
Les rotors peuvent être classés en trois grandes catégories, lesquels?
les rotors à godets oscillants, les rotors à angle fixe et les rotors verticaux.
À noter que chaque type de rotor comporte ses forces et ses faiblesses selon le type de séparation désiré.
V OU F?
En ce qui concerne l’utilisation des ultracentrifugeuses:
a- les ultracentrifugeuses crées un vacuum dans la chambre du rotor pour permettre d’obtenir de très hautes vitesses de centrifugation sans avoir la friction de l’air, ce qui peut amener un échauffement des échantillons
b- les vitesses obtenues sont très élevées (de l’ordre de 80,000 à 100,000 rpm) - de plus, la chambre du rotor est réfrigérée pour éviter le réchauffement des
échantillons
c- à ces vitesses, il est essentiel de:
- > bien balancer le rotor pour éviter tout débalancement lors de la centrifugation
- > utilisez le bon rotor!
Tous sont vraies
Expliquez RPM vs RCF
La force centrifuge appliquée sur l’échantillon est exprimée de deux manières : la vitesse de rotation, exprimée en RPM (Rotation Par Minute), ou les RCF (« Relative Centrifugal Force »), exprimée en g. La relation entre les deux dépend uniquement du rayon du rotor utilisé.
Ainsi, RCF = 1.117 x 10-5 x R x N2 avec RCF en g, où R est le rayon du rotor en cm pris entre le centre du rotor et le point dans le tube où la valeur RCF est requise et N la vitesse de rotation en RPM. La conversion peut également se faire à l’aide de tableau fourni pour divers rotors en utilisant le rayon moyen.
