Cours 4 - (Ultra) Centrifugation Flashcards
Nommez les 2 types de centrifugations + sous-types
Centrifugations différentielles
Centrifugation préparative
-L'ultracentrifugation en
zones
-L'ultracentrifugation par
densité d'équilibre
Expliquez la sédimentation d’une molécule sphérique
Si le liquide a une densité do et la molécule a une densité de d
et si d > do la protéine volonté sédimente
Beaucoup d’expériences en biochimie exigent une ou plusieurs étapes de centrifugation. Expliquez le principe de cette méthode
Cette technique permet d’exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. On peut ainsi fractionner une préparation en un sédiment (ou “culot”), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au dessus du sédiment.
Nommez et expliquez les 3 types de centrifugeuses
1- les centrifugeuses de table, utilisées notamment pour centrifuger des tubes Eppendorf de 1.5 mL
2- les centrifugeuses à haute vitesse, permettant la centrifugation jusqu’à 40,000 g pour des volumes allant jusqu’à 50 ou 100 mL
3- les ultracentrifugeuses permettant d’aller jusqu’à des vitesses de 100,000 g.
V OU F?
a- le comportement des macromolécules en solution, qui sont soumises au champ gravitationnel (facteur accélération g = 9.81 ms2), ne démontre aucune évidence de sédimentation
b- l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon hétérogène en solution
c- c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à de faibles accélérations qu’elles commencent à sédimenter.
d- L’ultracentrifugeuse fut inventée en 1923 par un chimiste suédois, Theodor Svedberg (prix Nobel de chimie 1926)
e- avec ce type de centrifugeuse, il est possible d’atteindre des vitesses de rotation de 150,000 rpm (révolutions par minute) qui donnent lieu à des forces dépassent 1,000,000 X g
f- Avec cette technique, Sverdberg a pu démontrer que les protéines sont des macromolécules de composition hétérogène et qu’un petit nombre de protéines sont composées de sous-unités.
a- VRAI
b- FAUX
l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon homogène en solution
c- FAUX
c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à des accélérations énormes qu’elles commencent à sédimenter.
d- VRAI
e- VRAI
f- FAUX
Avec cette technique, Sverdberg a pu démontrer que les protéines sont des macromolécules de composition homogène et qu’un grand nombre de protéines sont composées de sous-unités.
la vitesse avec laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de quoi?
Expliquez
sa masse
la force, Fsédimentation, subie par une particule de masse m est égale à la force centrifuge (mω2r) qui s’exerce sur la particule moins la force due
au déplacement de la solution par la particule (Vpρω2r ou force de flottaison)
Fsédimentation =
mω2r - Vpρω2
où : m est la masse de la particule w est la vitesse angulaire r est le rayon de gyration Vp est le volume de la particule ρ est la densité de la solution
En ce qui concerne la sédimentation, le déplacement d’une particule à travers une solution est opposée par quelle force ?
Cependant, le déplacement d’une particule à travers une solution est opposée par une force qui représente
la friction entre la particule et la solution
F friction = v f
où v est la vitesse de migration de la particule et f est le coefficient de friction
Expliquez la phase stationnaire
Sous l’influence d’une force centrifuge, une particule va accélérer jusqu’à ce que toutes les forces soient contrebalancées, soit :
mω2r - Vpρω2r = v f
où on atteint la phase stationnaire
À quoi peut servir la technique de sédimentation? Expliquez
À mesurer la masse de macromolécules
VOIR DIAPO POUR DÉMARCHE MATHÉMATIQUE
la masse des constituants de ces complexes est souvent exprimé en ______
Svedberg (S)
Ex. ribosome bactérien 30S et 50S…
Quelle est la 1ère étape dans la purification des protéines? pourquoi?
les dissoudre dans une phase liquide
- les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
- le plus souvent, leur libération ne demande que la lyse des cellules
Avant de concevoir un protocole pour lyser des cellules, vous devez choisir entre deux options lorsque vous utilisez un protocole / méthodes pour lyser des cellules, lesquelles?
- garder les protéines intactes (étudier la fonction des protéines)
- dénaturer les protéines (pour l’extraction d’ADN ou d’ARN)
Complètez:
En centrifugation différentielle, la séparation s’effectue principalement selon _______.
Ce type de séparation est couramment utilisé pour la récupération de _____ et l’obtention de ________.
Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut _______ afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de ______ se nomme ________.
Pendant la centrifugation d’un _______, les particules plus grosses _____ plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la base de l’obtention de ________ par centrifugation différentielle.
Un _______ de cellules peut être soumis à une série de forces g et de durées croissante afin de générer des ________.
En centrifugation différentielle, la séparation s’effectue principalement selon [la taille des particules].
Ce type de séparation est couramment utilisé pour la récupération de [culots] et l’obtention de [préparations partiellement pures d’organelles sub-cellulaires et de macromolécules.]
Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut [rompre les tissus ou les cellules] afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de [cellules fractionnées] se nomme [homogénat].
Pendant la centrifugation d’un [homogénat de cellules], les particules plus grosses [sédimentent] plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la base de [l’obtention de fractions d’organelles brutes] par centrifugation différentielle.
Un [homogénat] de cellules peut être soumis à une série de forces g et de durées croissante afin de générer des [culots d’organelles partiellement purifiées].
Quel est le principe de la centrifugation différentielle?
Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une première centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot au fond du tube.
Décrire la centrifugation préparative
- Les centrifugeuses préparatives sont conçues pour la préparation d’échantillons possédant des volumes significatifs
- La sédimentation peut être faite dans une solution inerte comme le saccharose
ou de chlorure de césium (CsCl) dans lesquels la concentration et donc la densité augmente du haut vers le bas du rotor - L’utilisation de gradients de densité augmente de façon significative le pouvoir de résolution de la centrifugeuse.
