Cours 1 - Isolement des protéines Flashcards
Quelles sont les 4 concepts à considérer pour l’isolation des protéines?
1- La solubilisation d’une protéine
2- L’effet de la concentration de sel
3- L’effet du pH
4- L’effet des solvants organiques
Quelle est la première étape dans la purification des protéines? Pourquoi?
Les dissoudre dans une phase liquide
CAR :
- les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
-le plus souvent, leur libération ne demande que la lyse des cellules
Avant de concevoir un protocole pour lyser des cellules, vous devez choisir entre deux options lorsque vous utilisez un protocole / méthodes pour lyser des cellules, lesquels?
- garder les protéines intactes (étudier la fonction des protéines)
- dénaturer les protéines (pour l’extraction d’ADN ou d’ARN)
Compléter : La plupart des tissus exigent cependant une \_\_\_\_ \_\_\_\_ afin de briser les cellules et permettre l'accès à leur contenu interne. Les techniques utilisées sont : 1 \_\_\_\_\_ 2 \_\_\_\_\_ 3 \_\_\_\_\_ 4 \_\_\_\_\_ 5 \_\_\_\_\_ 6 \_\_\_\_\_
désintégration mécanique
- déchiquetage mécanique (blender de type Waring)
- broyage avec du sable, de l’alumine ou des billes de verre de petite
taille; - homogénéisateur (Potter en téflon) ;
- rupture par haute pression (French press) ; 5. sonication par vibration ultrasonique
- Cryolyse
Expliquer la méthode la plus douce et la plus simple pour lyser les cellules.
La lyse osmotique :
Les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique (solution dont la concentration molaire en solutés est inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule)
Cette différence en concentration résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule
Quelle est la concentration saline physiologique ? (dans une cellule)
La cellule peut-elle fonctionner sans sel?
150 mM
Non, la cellule ne peut pas fonctionner si la concentration saline n’est pas spécifiquement à 150 mM
Qu’est-ce que le SDS?
SDS signifie «sodium dodecyl sulfate» est un détergent anionique solide qui peut solubiliser les protéines et les lipides qui encadrent les membranes. Cela aidera les membranes cellulaires à séparer et à exposer les chromosomes contenant l’ADN. SDS libère l’ADN d’histones et d’autres protéines de liaison à l’ADN en les dénaturant.
Qu’est-ce que la protéinase K?
La protéinase K, une sérine protéase, est utilisée dans de nombreux protocoles d’extraction d’ADN pour digérer ces protéines contaminants.
Que doit-on ajouter lorsqu’on veut lyser des cellules bactériennes ou végétales?
Avec des cellules bactériennes, de levures ou végétales, l’utilisation une enzyme qui dégrade les parois cellulaires, est nécessaire, par example de lysozyme
Une fois les cellules brisées, le lysat obtenu peut être filtré ou centrifugé afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant ainsi la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution
L’intégrité structurale des protéines et leur stabilité dépendent de plusieurs facteurs, lesquels?
Le pH, la température et les protéases
Expliquer l’influence du pH sur l’intégrité structurale et la stabilité des protéine.
utilise des solutions tampon qui maintiennent le pH dans une zone “physiologique” (6.5-7.5/8.0) pour éviter d’endommager les protéines par des variations brusque de pH.
Expliquer l’influence de la température sur l’intégrité structurale et la stabilité des protéine.
- les protéines sont facilement dénaturées à hautes températures
- plusieurs protéines se dénaturent lentement lorsque conservées à 25C
- la purification des protéines se fait normalement à des températures proches
de 0-5C car toutes les réactions sont ralenties = préserve bon les fonctions et l’intégralité de la protéine - une fois purifiées, les protéines peuvent se conserver à long terme à des
températures de –20 à -80C
Expliquer l’influence des protéases sur l’intégrité structurale et la stabilité des protéine.
- les cellules contiennent des protéases (enzymes qui hydrolysent les liens peptidiques) - ces protéases sont libérées lors de la lyse cellulaires et peuvent dégrader les
protéines lors de la purification - l’ajout d’inhibiteurs de protéases permet d’empêcher cette dégradation
Les protéines sont purifiées par quel type de méthodes?
Par des méthodes de fractionnement : on utilise les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine étudiée pour l’isoler progressivement des autres substances cellulaires
Quelles sont les types de propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes techniques de séparation?
- la solubilité
- la charge ionique
- la taille moléculaire
- les propriétés d’adsorption et de liaison à d’autres molécules biologiques
