Cours 2 - Chromatographie

Question 1

Donnez les 3 méthodes de chromatographie à l’étude + leurs utilités

Answer 1

1. Échangeur d’ions –> Séparer par rapport à la charge
2. Tamis moléculaire –> Séparer par rapport à la taille/forme
3. Chromatographie d’affinité –> Utiliser des molécules spécifiques pour cibler des protéines spécifiques et les purifier

Question 2

V OU F?

Chromatographie: méthode utilisée pour séparer des mélanges complexes

Answer 2

VRAI

Question 3

Donner 2 caractéristiques de la chromatographie

Answer 3

• Basée sur l’utilisation d’une phase mobile, qui contient le mélange de substances à fractionner, et une phase stationnaire, au travers de laquelle les substances sont séparées.
• les interactions des différentes substances avec la phase stationnaire ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les propriétés respectives de chaque substance

Question 4

Donner les 3 les propriétés communément utilisées pour

effectuer le fractionnement

Answer 4

A. Les interactions ioniques
(chromatographie par échange d’ions)

B. La taille (chromatographie par gel-filtration)

C. La spécificité (chromatographie d’affinité)

Question 5

Expliquez le processus d’échange d’ions de la chromatographie par échange d’ions

Answer 5

dans un processus d’échange d’ions, les ions liés électrostatiquement à un support insoluble sont remplacés de manière réversible par des ions en solution:

R+ A- + B- R+ B- + A-

où R+ A- est un échangeur d’anions, sous la forme A-

Question 6

Quelle est la structure d’un échangeur de cations ?

Et les protéines?

Answer 6

un échangeur de cations porte des groupes chargés négativement et lierait des cations de manière réversible

les protéines portent à la fois des charges positives et négatives et peuvent lier à
la fois un échangeur d’anions ou de cations

Question 7

l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de 2 facteurs, lesquels?

Answer 7

1) du pH de la solution, puisque la charge nette des protéines varie selon le pH
2) de la nature et des concentrations des autres ions en solution, qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions

Question 8

Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de deux caractéristiques importantes, lesquelles?

Answer 8

• La nature de leur matrice.

- Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine

Question 9

Expliquez les matrices utilisées pour la chromatographie par échangeurs d’ions (structure, fonction, caractéristique)

Answer 9

• les matrices utilisées en chromatographie sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes, appelées familièrement résines
• les polymères le plus souvent utilisés sont des polysaccharides comme le cellulose ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères, nouveaux
  perles céramiques rigide (silica)
• ces polymères sont suffisamment poreux afin de permettre
  la pénétration d’une protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l’extérieur de la bille (Figure 1)

Question 10

V ou F?

Les échangeurs d’ions exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine à un pH donné qui leur permettent d’interagir par attraction électrostatique

Answer 10

VRAI

Question 11

Nommez + expliquez les 2 classes d’échangeurs

Answer 11

• les échangeurs anioniques qui portent une charge positive

- les échangeurs cationiques qui possèdent une charge négative

Question 12

Complètez : En ce qui concerne la chromatographie par échangeurs d’ions

Chaque classe d’échangeurs se divise en groupe dit « ____ ______» qui reste ______ chargé entre pH ~ __ et ~ __ et « échangeur ____ » qui est chargé dans une _____ de ____ plus ______.

Answer 12

Chaque classe d’échangeurs se divise en groupe dit [«échangeur fort »] qui reste [pleinement] chargé entre pH ~ [3] et ~ [10] et [« échangeur faible »] qui est chargé dans une [gamme de pH plus restreint.]

Question 13

Nommez les 4 types de groupements chimiques qui greffés sur les matrices

Answer 13

QAE - amine quaternaire - (N+ pKa ~ 9.5) –> échangeur anionique fort.

sulfonates –> échangeur cationique fort.

DEAE - amine tertiaire - partiellement chargé à partir de pH 7 à 8 –> échangeur anionique faible.

CM - carboxyméthyle - pleinement chargé à partir de pH 4.5 –> échangeur cationique faible.

Question 14

Donnez les 3 étapes du principe d’opération de la chromatographie par échangeurs d’ions

Answer 14

1- Liaison à la colonne
2- Lavages
3- Élution

Question 15

Expliquez le principe de la liaison à la colonne. Parlez de l’affinité, de contre-ions, pH et de concentration saline

(principe d’opération de la chromatographie par échangeurs d’ions)

Answer 15

• les protéines se lient aux échangeurs par des forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupements chargés sur l’échangeur
• Cependant, les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions
  (ions métalliques, des ions de sel, ou des ions du tampon).
• Une protéine doit alors déplacer les contre-ions pour s’attacher
• Comme la protéine est également neutralisée par des contre-ions, la protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer

e pH et la concentration saline de la solution dans laquelle la protéine est dissoute sont choisis de sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ion

Question 16

Expliquez le principe de lavages. Parlez de solution tampon, d’affinité et de migration

(principe d’opération de la chromatographie par échangeurs d’ions)

Answer 16

• une fois la solution de protéines est appliqué sur le haut de la colonne contenant l’échangeur, la colonne est lavée avec une solution tampon
• les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités différentes
• les protéines ayant une affinité relativement faible pour l’échangeur d’ions migreront plus rapidement dans la colonne que celles qui lient l’échangeur avec une plus forte affinité
• plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée

Question 17

Expliquez le principe de l’élution. Parlez de concentration saline, de type d’élution (2), de gradient linéaire et de sels tel que KCl et NaCl

(principe d’opération de la chromatographie par échangeurs d’ions)

Answer 17

• les protéines liées à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage => procédé d’élution fractionnée (Figure 4)
• les gradients de sels sont le moyen le plus souvent utilisés afin d’éluer les protéines adsorbées sur l’échangeur => procédé d’élution par gradient
• l’utilisation d’un gradient linéaire, où la concentration saline de la solution
  d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne, permet de libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions
• normalement le KCl ou le NaCl sont utilisés pour former des gradients;
• le sel déplace directement la protéine; les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine

Question 18

Expliquez le principe de la chromatographie par gel-filtration (tamis moléculaire)

Answer 18

Principe de filtration sur gel afin de séparer des protéines de tailles différentes sur une colonne. Les protéines de grandes tailles sont exclues de la plupart de pores, et par conséquent se déplacent avec le front du tampon.

Question 19

Dans la technique de chromatographie par gel-filtration, les molécules sont séparées selon leur taille et leur forme

Donnez les 3 principes de cette méthode

Answer 19

1) la phase stationnaire (résine) consiste en un
réseau de polymères réticulé possédant des pores, fabriqué sous forme de billes

2) les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre
la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille => la limite d’exclusion

3) les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes

Question 20

Expliquez les matrices utilisées pour la chromatographie par gel-filtration (structure, fonction, caractéristique)

Answer 20

• les matrices utilisées sont faites de polymères insolubles à base de polysaccharides comme le dextrane (Sephadex) ou l’agarose (Sépharose), ou de polyacrylamide (Bio- Gel), préparées sous la forme de billes réticulées (poreuses)
• dans des conditions optimales, tous les pores
  sont accessibles aux protéines, mais pas n’importe quelle taille de protéines peuvent y accéder

Question 21

La porosité des gels (matrices) utilisées pour la chromatographie par gel-filtration dépend de deux facteurs, lesquels?

Answer 21

• de la masse moléculaire du polymère

• du nombre de liaisons croisées qui se
forment entre les molécules du polymère (pontages)

Question 22

Expliquez la limite d’exclusion des gels (matrices) utilisées pour la chromatographie par gel-filtration

Answer 22

• les meilleures billes de gel ont des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes –> la limite d’exclusion
• les limites d’exclusion varieront de 0.8 à 800 kDa pour le Sephadex, et jusqu’à 40 000 kDa pour le Sepharose

Question 23

V OU F?
Les protéines dont la masse moléculaire est inférieure à la limite d’exclusion des billes seront éluées de la colonne selon leur masses moléculaires: les plus grosses étant éluées en premier

Answer 23

VRAI ***

Question 24

Comment détermine-t-on le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve)?

Answer 24

Le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve) peut être déterminé quantitativement => c’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne

En utilisant l’équation:
Vt = Vx + Vo

où
Vx = le volume occupé par les billes
Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt)
Vt = le volume total de la colonne

Question 25

Est-il possible de mesurer le volume d’élution relatif (Ve/V0) d’une protéine?

Answer 25

Oui

• il existe une relation linéaire entre le volume d’élution relatif d’une protéine et le logarithme de sa masse moléculaire
• à partir d’un graphe, il est possible d’estimer la masse d’une protéine inconnue en connaissant son volume d’élution relatif

Question 26

Expliquez ce qu’est la dialyse

Answer 26

Une forme de filtration moléculaire

La dialyse permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l􏰀utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure
aux protéines

Ces pores permettent aux petites molécules, comme les sels et les métabolites,
de diffuser au travers de la membrane, mais empêchent la diffusion de plus grosses molécules

Question 27

Quelles membranes sont utilisées lors d’une dialyse?

Answer 27

Les membranes utilisées sont à base de cellophane (cellulose)

Question 28

La technique de dialyse est fréquemment utilisée pour quoi exactement?

(indice: sel)

Answer 28

Cette technique est fréquemment utilisée pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions

La solution de protéines et de sels est mise à l’intérieur d’un sac à dialyse, puis immergée dans un large volume de tampon. Après plusieurs heures, les solutions se retrouveront à l’équilibre grâce à la diffusion des sels de l’intérieur du sac vers le tampon de dialyse

Question 29

Nommez la technique de séparation basée sur des interaction:
• spécifique
• réversibles entre des molécules.

Answer 29

La chromatographie d’affinité

Question 30

Expliquez la technique de la chromatographie d’affinité

Answer 30

• dans cette technique, un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte
• quand un solution contenant un mélange de protéines traverse la colonne, la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne
• on peut alors récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand

Question 31

Comment peut-on récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand? (2)

Answer 31

1- soit en ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne ( celui-ci entre en compétition pour la liaison de la protéine)

2- ou en changeant le pH, la force ionique et/ou la température

Question 32

V ou F?

a) La chromatographie d’affinité possède le grand avantage d’exploiter les propriétés biochimiques uniques de la protéine d’intérêt, au lieu d’utiliser des propriétés physico-chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines
b) Cette approche possède aussi l’avantage de pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en plusieurs étapes

Answer 32

a) VRAI

b) FAUX
Cette approche possède aussi l’avantage de pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape

Question 33

Expliquez l’interaction protéine-ligand

Answer 33

La liaison d’une protéine P à un ligand L peut être représenté par cette équation:
P+L P-L

où le Kd représente la constante de dissociation (une mesure de l’affinité protéine-ligand)

Quand le ligand est couplé à une matrice M, l’équation devient:
P + L-M P-L-M

La liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand
-> le Kd’ devrait varier entre 10-4 M et 10-10 M

Question 34

La quantité de protéine retenue sur la colonne d’affinité (P-L-M) dépend de 3 facteurs, lesquels?

Answer 34

• du Kd’ (l’interaction est trop faible si la valeur >10-4 M)
• de la concentration de protéine dans l’extrait
• du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M)

Question 35

Nommez quelques exemples de tag et de ligands utilisées couramment au laboratoire

Answer 35

• His-tag
• FLAGTM peptide
• Strep-tag
• GST tag
• Maltose binding protein fusion
• Calmodulin binding protein fusion
• Transition metal ion
• Monoclonal antibody
• Biotin
• Glutathione
• Amylose
• Ca2+

Question 36

Donnez les 3 caractéristiques de la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité

(quel polymère est le plus fréquemment utilisé)

Answer 36

La matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être:

• chimiquement inerte
• avoir une grande porosité
• présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands

L’agarose est le polymère le plus fréquemment utilisé

Question 37

En ce qui concerne la chromatographie d’affinité, la liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose se fait en deux temps, lesquels?

Il y a-t-il un problème avec cette méthode? Comment l’éviter?

Answer 37

1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence

Cependant, plusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé
au bromure de cyanogène à cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose

Pour éviter ce problème, un bras “espaceur” souple est ajouté entre la matrice et le ligand

Question 38

V OU F? + Expliquez

La synthèse de l’agarose est inhibé par le bromure de cyanogène

Answer 38

FAUX

La synthèse de l’agarose est activée par le bromure de cyanogène

L’agarose activée réagit avec une amine primaire pour former un lien covalent entre un ligand (RNH2) et la
matrice

Question 39

Expliquez le problème entre la liaison d’un ligand à une matrice + la solution

Answer 39

La protéine ne peut pas lier le ligand lorsque ce dernier est couplé directement à la matrice d’agarose

L’ajout d’un bras espaceur de 6 atomes de carbones permet à la protéine d’avoir accès au ligand

Plusieurs matrices, disponibles commercialement, possèdent des groupes réactifs, comme l’époxy (d) séparées de la matrice par un bras espaceur

Question 40

Lorsqu’on purifie une ou des protéines par chromatographie, il faut une méthode qui permette de la ou les détecter quantitativement et spécifiquement dans les différentes fractions de l’éluat, nommez les 5 méthodes utilisées

Answer 40

1- absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre
2- essai colorimétrique
3- essai enzymatique
4- détection de la protéine sur gel SDS-PAGE
5- détection de la protéine avec un anticorps

Question 41

Expliquez :

1- absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre
2- essai colorimétrique
3- essai enzymatique
4- détection de la protéine sur gel SDS-PAGE
5- détection de la protéine avec un anticorps

Answer 41

1- absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre

• les protéines absorbent la lumière autour de 280nm
• méthode non spécifique

2- essai colorimétrique (essai de Bradford)

• contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une couleur mauve à la solution -> l’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration de protéine en solution
• méthode non spécifique

3- essai enzymatique
- pratique si la protéine à purifier est une enzyme

4- détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant)
- permet de déterminer le degré de pureté de la protéine

5- détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot)
- très spécifique