Cours 5 - Manipulation des acides nucléiques Flashcards
Nommez les 4 manipulations des acides nucléiques possibles
A. Solubilité et précipitation de l’ADN
B. Électrophorèse de l’ADN
C. Chromatographie des acides nucléiques
D. Ultracentrifugation et purification de l’ADN
Quel principe est utilisée pour la purification des acides nucléiques?
Les propriétés physico-chimiques des acides nucléiques
Nommez les propriétés physico-chimiques qui permettent de purifier les acides nucléiques
- polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides
- composés d’une forte charge négative
- adoptent une structure en double brins
Expliquez la solubilité et la précipitation de l’ADN
- l’ADN est très soluble dans l’eau: molécule très chargée + peu de groupements hydrophobes
- Comme pour les protéines, sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou la présence de substances organiques dans l’eau
Quelle est la façon habituelle de précipiter l’ADN?
la précipitation à l’éthanol (ou isopropanol) est la façon habituelle de précipiter l’ADN pour le concentrer ou changer son tampon
(cette approche est similaire à la précipitation des protéines avec des solvants organiques)
Donnez les 3 étapes expérimentales pour la précipitation de l’ADN à l’éthanol
- la précipitation consiste en l’ajout de 2.5 volumes d’éthanol à une solution contenant de l’ADN et 0.25M d’acétate de sodium
- la solution est ensuite mise à -20C pendant au moins 30 minutes et l’ADN est récupéré par centrifugation à 10,000 rpm pendant 10 minutes à 4C dans une microcentrifugeuse
- une certaine quantité de sels sera aussi précipité avec l’ADN. Des lavages subséquents avec de l’éthanol permettra de les enlever.
Il y a-t-il un autre solvant qui peut être utilisé pour la précipitation de l’ADN?
autre solvants organique utilisé pour la précipitation:
isopropanol
comment séparer l’ADN des protéines?
Est-ce que les protéines sont dénaturés?
Extraction de l’ADN au phénol
- méthode de partition de phase dans laquelle les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des deux phases.
OUI, LES PROTÉINES SONT DÉNATURÉS
Donnez les étapes expérimentales pour faire une extraction de l’ADN au phénol
- le pH du phénol doit d’abord être ajusté à un pH autour de 8 (l’ADN est partiellement soluble dans le phénol acide)
- agiter doucement 1 vol du phénol neutralisé avec 1 vol de la solution contenant de l’ADN et extraire
2 fois - les traces résiduelles de phénol peuvent être éliminées par extraction avec du chloroforme immédiatement après
- le chloroforme est éliminé facilement par précipitation avec de l’éthanol
- très fréquemment des protéases, telle que la protéinase K, sont utilisées pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol
Dans la technique de PCR, la température d’hybridation des amorces dépend de quoi?
1- la longueur de celles-ci (plus les amorces sont longues et plus la température d’hybridation est élevée)
2- leur composition en nucléotides (plus le pourcentage en nucléotides G ou C augmente et plus elle est élevée).
De plus, à 72C, la Taq polymérise l’ADN à une vitesse d’environ 1000 bases par minute.
Il faudra donc ajuster le temps de polymérisation en fonction de la taille de l’ADN à amplifier.
La température de fusion (Tm) d’une amorce peut être calculée à l’aide de la formule suivante : Tm = (nG + nC) x 2 + (nA + nT) x4 avec nG le nombre de nucléotides G dans la séquence.
La température d’hybridation est, quant à elle, de 5C en dessous du Tm.
Donnes les 3 conditions de bases d’une amplification RAPD PCR qui diffèrent de la PCR classique
- Chaque réaction de PCR n’utilise qu’une seule amorce et non deux
- La température d’hybridation des amorces est extrêmement basse : 35 C
- La longueur de l’amorce utilisée est très courte : 10 pb
Permettent l’hybridation aléatoire de l’amorce sur la matrice d’ADN. C’est-à-dire qu’une seule et même amorce pourra se fixer à plusieurs endroits sur les brins d’ADN. Il y aura ensuite amplification de l’ADN entre les différentes positions de fixation de l’amorce. Il est important de garder en tête que même si on dit que la fixation des amorces est aléatoire, cela ne veut pas dire qu’il n’existera pas un patron d’amplification reproductible pour une matrice d’ADN donnée. Ainsi, on s’attend à ce que le PCR de l’étudiant A pour une amorce x, diffère de celui de l’étudiant B pour la même amorce, mais on s’attend aussi, si l’expérience est répétée plusieurs fois avec la même amorce, à retrouver à peu près le même patron d’une fois à l’autre pour l’étudiant A et de même pour les amplifications de l’ADN de l’étudiant B.
V OU F?
Tous les ADN polymérases ne sont pas identiques
VRAI
Expliquez pourquoi nous pouvons faire une électrophorèse de l’ADN.
Puisque les acides nucléiques sont des molécules chargées (négativement), elles peuvent migrer dans un gel d’électrophorèse, comme les protéines
Quel sera le gel utilisé pour l’électrophorèse de l’ADN?
À cause de leur grande taille, les acides nucléiques pénètrent difficilement dans les gels de polyacrylamide -> ces gels sont utilisés pour la purification ou l’analyse d’acides nucléiques de quelques centaines de nucléotides seulement
on utilise habituellement les gels d’agarose pour purifier et analyser les acides nucléiques
ces gels, contenant de 0.5 à 2% d’agarose, permettent de séparer des fragments d’ADN de quelques centaines à plusieurs milliers de nucléotides
Expliquez le fonctionnement de l’électrophorèse de l’ADN
- l’ADN est chargé dans les puits du gel et migrera vers l’anode lors de l’électrophorèse
- on utilise un tampon contenant de l’EDTA pour inhiber l’activité des nucléases qui peuvent être présente dans la solution; le pH du tampon est autour de 8
- comme pour les protéines, la séparation s’effectuera selon la masse moléculaire de l’ADN, qui dépend de la taille des fragments d’ADN:
fragments petits migrent plus rapidement que les grands
