Cours 4 Flashcards
Quelle est la différence entre le brin codant et le brin matrice?
Le brin codant est le brin dont on va faire la séquence cocmplémentaire pour obtenir un ARNm.
Le brin matrice est le brin qui sert de “matrice” pour faire cet ARNm. C’est le brin complémentaire au brin codant. L’ARNm est complémentaire au brin matrice.
Que signifie “codon”?
Deux définitions:
1-Le brin codant
2-Le triplet de rNTP sur l’ARNm qui va être transformé par l’ARNt et le ribosome en protéine.
On sait que la réparation d’un mésappariement nécessite l’identification de l’erreur, du brin erronné et corriger l’erreur rapidement. Chez e coli quelle protéine est responsable de quoi?
- Pour identifier le brin erroné, il suffit de regarder sur quel brin se trouve le groupement méthyl sur une séquence GATC (5’-3’). En effet, seul le brin parental s’est vu attribuer un methyl sur son A par l’enzyme methyltransférase Dam. Le nouveau brin n’a pas encore reçu le methyl.
- Pour identifier le nt erroné, la cellule fait appel à une protéine MutS, dimère, qui parcourt l’ADN à la recherche d’une mutation. Lorsqu’elle en trouve une, elle change de conformation, se resserre, et expose ses sites de liaison pour l’ATP. La liaison de l’ATP fait en sorte qu’elle attire la protéine MutL.
- Pour corriger l’erreur, MutL doit activer MutH, une enzyme déjà placée sur le segment GATC. 3 hypothèses existent pour expliquer cette interaction. Au final, MutH fait une coupure du brin avec la mutation, en 3’ ou en 5’. Une exonucléase dégrade ensuite le brin jusqu’à la mutation et un peu plus loin. Il existe une nucléase qui va vers le 5’ (exonucléase 1) et une qui va vers le 3’ (exo VII). Un ADN pol I va ensuite polymériser et une ligase va joindre les deux bouts.
Sachant que les trois modifications suivantes sont les altérations spontanées les plus fréquentes, place ces mutations en ordre de facilité de reconnaissance par le système de réparation:
1-Remplacer C par U
2-Remplacer G par OH (enlever la base)
3-Remplacer C-CH3 par T
1-Remplacer C par U
2-Remplacer G par OH (enlever la base)
3-Remplacer C-CH3 par T
Le fait de remplacer un nucléotide propre à l’ADN par un nucléotide propre à l’ARN permettra au système Mut de reconnaître rapidement qu’un nt étranger a été mis sur place.
Le fait de perdre la base sera reconnaissable très rapidement par le système Mut, car il s’agit d’une part très importante du nucléotide, qui occupe beaucoup d’espace. L’interaction avec l’autre base est complètement supprimée.
Finalement, le fait de remplacer la cytosine méthylée par un T sera moins facilement reconnaissable, car le changement est subtil et repose dans la soustraction d’une seule molécule NH3. L’identité du nt change, mais pas aussi radicalement que s’il devenait un rNTP.
Ici, CG a été changé pour TG, mais ce sera difficile de savoir, doit-on changer le T ou le G? On ne sait pas si c’est le T le problème, quand on répare et donc qu’on devrait mettre C, ou si c’est le G le problème et donc qu’on devrait mettre A.
Quelles sont les causes des cassures db?
- Radiations ionisantes
- ROS
- Déplacement de transposons
- exposition à UV
- Recombinaison homologue
Pendant la transposition couper-coller, on a besoin des enzymes de réparation à deux endroits, quand et quelles sont les enzymes impliquées?
- Pour ressouder ensemble les deux brins d’ADN ayant perdu le transposon, il est possible de faire une NHEJ, ou de faire une SSA ou une AH-NHEJ.
On fera la NHEJ en dernier recours, si rien d’autre n’est possible.
- Pour compléter les brins (faire la duplication) une fois le transposon inséré dans l’ADN cible.
Pour ceci, il suffit d’utiliser l’ADN polymérase et la ligase. Il n’y a pas mésappariement. Il faut remplir la brèche à cause de l’insertion du transposon qui a produit deux coupures pas face à face.
L’ADN pol peut simplement rajouter des nucléotides sur l’extrémité 3’ OH libre. La ligase s’occupe de lier le segment créé à celui d’avant.
Sachant que les 3 catégories de transposons est: ADN, LTR et poly-A, si un transposon se trouve incapable de faire sa propre transposition, est-ce qu’il peut se servir de ses semblables pour l’aider à bouger?
Un transposon ADN se trouverait incapable de bouger s’il n’a pas de site avec une répétition inversée ou s’il y a une mutation dans son enzyme transposase. Dans ce dernier cas, l’enzyme OFR2 du rétrotransposon non-viral (poly A) possède une caractéristique endonucléase et pourrait faire une coupure. Par contre, encore faudrait-il qu’elle puisse reconnaître ce transposon. Si le problème réside dans la traduction, les rétrotransposons poly A et LTR pourraient simplement utiliser leur activité reverse transcriptase pour former un segment d’ADN à partir de l’ARNm codant la transposase. Un transposon ADN pourrait aider un autre de ses semblables sans problème.
LTR en particulier ne pourrait pas bouger s’il ne possédait pas son segment U3. Il s’agit d’un promoteur alors il est essentiel pour transcrire le LTR. S’il ne possède pas U3, cela signifie qu’il ne posséderait pas non plus le site PBS nécessaire à l’attachement de l’ARNt et donc pas non plus le site R nécessaire pour le premier saut d’amorce. L’endonucléase ORF2 devra donc couper le rétrotransposon, admettons qu’elle puisse le reconnaître, mais rien ne pourrait insérer le transposon dans l’ADN, puisque c’est lui-même qui code l’intégrase. Si ce sont les protéines intégrases et rétrotranscriptases qui sont défectueuses, il serait possible d’utiliser les protéines d’un autre transposon LTR.
Le rétrotransposon poly A ne pourrait pas être transcrit s’il manquait sa séquence 5’UTR, car son premier nucléotide est un promoteur. Il pourrait être clivé à l’aide de la transposase du transposon ADN…si elle reconnaissait ce lieu. Pour être inséré, il pourrait utiliser les fonctions endonucléases et intégrases du rétrotransposon LTR. Si ce sont les protéines ORF1 et ORF2 qui sont inefficaces, il serait possible d’utiliser ces mêmes protéines provenant d’un autre transposon poly A.
Dans ces deux derniers cas, si la transcription est impossible, ils ne pourront pas être aidés par leurs semblables.
L’expansion de la population de transposons est provoquée par quels types de mécanismes de transposition?voir tableau du génome humain chapitre 2 et % des différents types de transposons- pourquoi certains sont plus nombreux que d’autres?
Par les transposons de type réplicatif.
Le type retroviral est plus nombreux que le type DNA only.
Quelle enzyme produit des fragments plus longs d’ADN lorsqu’elle est utilisée pour couper l’ADN génomique?
Une enzyme dont le site de restriction est composé de 4 nucléotides produira de plus petits fragments. En effet, il y a plus de chances de trouver une même séquence composée de 4 nucléotides dans le génome, versus de retrouver une séquence composée de 7-8 nucléotides. Il y a plus de sites de restriction de 4 nucléotides identiques, alors l’ADN sera coupé plus souvent. Cela produira de plus petits morceaux.
Quel est l’avantage du #2 vs le #1-quel est l’avantage d’utiliser deux enzymes différentes qui font en sorte que le site de restriction n’est pas reproduit?
L’avantage est que les enzymes n’auraient pas à être retirées du système #2, tandis qu’elles devraient être retirées du système #1. Elles briseraient trop rapidement le lien produit en #1.
La soudure des fragments ayant une coupure franche est plus difficile, quel mécanisme doit-on utiliser en plus de la ligase?
La coupure en escalier est mieux psk les bases peuvent créer des ponts H entre eux, ce qui rapproche les molécules, alors qu’on doit rapprocher les 2 molécules qui sont coupées de façon franche avant de les lier.
Il faudra créer une coupure en escalier. Pour cela, il sera possible d’utiliser le système de recombinaison homologue, le système NHEJ, SSA ou Alt-NHEJ. Pour utiliser SSA ou Alt-NHEJ, il faudra cependant trouver des séquences d’homologie répétées (100pb et quelques pb respectivement).
Durant la transposition ADN et LTR, les
bouts 3’-OH attaquent le nouveau site.
Cette attaque produit quel type de
coupure? Quelle est la conséquence?
C’est une coupure cohésive. Pour réparer cette coupure, qui laisse une brèche, il y a une duplication qui est créée.
Si on veut souder ensemble deux fragments ayant subi des coupures par la même enzyme de restriction, quel mécanisme de réparation peut-on utiliser?
On se retrouvera avec la production du même site de restriction. Étant donné que les extrémités seront homologues, il sera facile d’utiliser la recombinaison homologue rapidement.
