cours 1 - isolement des protéines

Question 1

Qu’elle est la première étape de la purification d’une protéine?

Answer 1

les dissoudres en phase liquide.

Question 2

Que veut dire la lyse de cellule?

Answer 2

La lyse est la destruction de la membrane d’une cellule biologique

Question 3

Avant de concevoir un protocole pour lyser des cellules, vous devez choisir entre deux options lorsque vous utilisez un protocole / méthodes pour lyser des cellules. Qu’elles sont les deux méthodes?

Answer 3

1. l’extraction de la protéine en la gardant les protéines intact (étudier leurs fonctions)
2. la dénaturation de la protéine pour l’extraction de l’ADN ou ARN.

Question 4

Pourquoi la désintégration mécanique est importante pour l’isolement d’une protéine?

Answer 4

Elle assure la destruction de la membrane plasmique (briser la cellule pour permettre l’accès à son intérieur)

Question 5

Qu’elle est la meilleur façon de briser la membrane cellulaire?

Answer 5

la lyse osmotique

Question 6

Explique moi le concept de la lyse osmotique?

Answer 6

Le concept derrière la lyse osmotique est l’expansion de la cellule due à une caractéristique d’équilibre de la cellule. La cellule est mis dans une solution moins salé que la cellule. Cela permet le passage d’eau de la solution à la cellule pour créer une équilibre. Cet solution est donc hypotonique.

Question 7

Pourquoi la lyse osmotique est plus efficace dans des cellules animales plutôt que des cellules végétales?

Answer 7

Les cellules animales ne constituent pas de paroi cellulaire

Question 8

pour les cellules végétales, bactériennes ou levures , quelle étape précède la lyse osmotique?

Answer 8

l’utilisation d’une enzyme pour détruire la paroi cellulaire.

Question 9

Donne un exemple d’enzyme capable de détruire la paroi cellulaire?

Answer 9

Lyzozyme

Question 10

Qu’elle est l’étape après l’obtention du lysat?

Answer 10

La solution peut être centrifugé pour enlever les débris laissant ainsi la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution et filtré

Question 11

pour l’isolement de l’ADN, est ce qu’il faut que les protéines soient préservées?

Answer 11

Non, l’isolement de l’ADN ne requirent pas la préservation de l’ADN.

Question 12

Pourquoi le SDS (sodium dodecyl sulfate) est utilisé lors de l’isolation de l’ADN?

Answer 12

Puisque c’est une substance qui est capable de solubiliser les protéines ainsi que les lipides ce qui facilite grandement l’isolement de l’ADN. SDS
libère l’ADN d’histones et d’autres protéines de liaison à l’ADN en les dénaturant.

Question 13

Qu’elle est le role de la protéinase K?

Answer 13

Elle peut digérer les protéines contaminants

Question 14

Qu’elles sont les trois facteurs qui influence la stabilité et l’intégrité structurale des protéines?

Answer 14

1. La température
2. le pH
3. les protéases

Question 15

Explique pourquoi/comment la température influence la stabilité et l’intégrité structurale des protéines?

Answer 15

les protéines sont facilement dénaturées à hautes températures. Plusieurs protéines se dénaturent lentement lorsque conservées à 25°C. Donc, la purification des protéines se fait normalement à des températures proches de 0-5°C

Question 16

Comment on évite la dénaturation lié au pH?

Answer 16

On utilise des solution tampon qui maintient le pH dans une zone physiologique.

Question 17

Comment on évite la dénaturation lié aux protéases?

Answer 17

on utilise des inhibiteurs de protéases

Question 18

Comment les protéases se retrouvent dans la solution?

Answer 18

Après la lyse osmotique, des protéases provenant de la cellule peuvent se retrouver dans la solution.

Question 19

Qu’est ce que le méthode de fractionnement?

Answer 19

le méthode de fractionnement est une façon d’isoler une protéine spécifique selon ces propriétés physico-chimique. Cette méthode permet d’isoler la molécule progressivement

Question 20

Qu’elles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les différentes techniques de
séparation?

Answer 20

• la solubilité
• la charge ionique
• la taille moléculaire
• les propriétés d’adsorption et de liaison à d’autres molécules biologiques

Question 21

Qu’elle est la technique de séparation pour la solubilité?

Answer 21

La précipitation

Question 22

Quels sont les technique de séparation pour la charge ionique? (3)

Answer 22

• chromatographie par échange d’ions
• électrophorèse
• focalisation isoélectrique

Question 23

Qu’elle est la technique de séparation pour la taille moléculaire?

Answer 23

• ultracentrifugation
• chromatographie par gel-filtration
• électrophorèse

Question 24

Qu’elle est la technique de séparation pour la spécificité?

Answer 24

• chromatographie d’affinité

Question 25

Qu’elle est une approche populaire pour l’isolement d’une protéine en dehors de sa cellule?

Answer 25

La précipitation

Question 26

Explique l’importance des interaction hydrophile et hydrophobe dans le contexte de l’isolation d’une protéine?

Answer 26

L’attraction entre la surface hydrophile de la macromolécule et les molécules d’eau
polaires crée une interface dans laquelle les molécules d’eau, orientées de façon similaire, s’associer à la surface du soluté et l’entourer pour former une couche hautement ordonnée appelée couche d’hydratation. La formation de couches d’hydratation améliore la solubilité des macromolécules en réduisant considérablement l’attraction dipolaire-dipolaire inter-macromoléculaire et en empêchant ainsi leur association avec d’autres solutés.

Question 27

Qu’est ce la couche d’hydratation?

Answer 27

L’attraction entre la surface hydrophile de la macromolécule et les molécules d’eau
polaires crée une interface dans laquelle les molécules d’eau, orientées de façon similaire, s’associer à la surface du soluté et l’entourer pour former une couche hautement ordonnée appelée couche d’hydratation

Question 28

La solubilité d’une protéine dépend de quoi?

Answer 28

1. des interactions polaire avec le solvant
2. des interactions ioniques avec le sels en solution
3. des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire

Question 29

Augmenter les interactions avec la solution,
diminuent quoi? Qu’elle est la conséquence sur l’isolement d’une protéine?

Answer 29

Augmenter les interactions avec la solution,
diminuent les interactions entre protéine. En conséquence, ces interactions avec le solvant empêche l’agrégation des protéines.

Question 30

Pourquoi l’agrégation des protéines est si importante a l’isolation d’une protéine?

Answer 30

C’est parce que l’agrégation des protéines est essentiel a la précipitation de protéines.

Question 31

à partir d’une certaine taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarrer quoi?

Answer 31

La force gravitationnelle ce qui mène à la précipitation

Question 32

à partir d’une certaine taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarrer quoi?

Answer 32

La force gravitationnelle ce qui mène à la précipitation

Question 33

Qu’elles sont les variations typiquement utilisées pour réduire la solubilité de la protéine dans le solvant?

Answer 33

1. la force ionique (concentration ionique)
2. ajout de solvant organique
3. le pH
4. ajout de polymère inertes

Question 34

La concentration saline dans le solvant est exprimé par quoi?

Answer 34

La force ionique (I)

Question 35

La solubilité de la protéine augmente ou diminue avec l’augmentation de la concentration saline?

Answer 35

La solubilité de la protéine augmente avec la concentration saline.

Question 36

Explique que veut dire “salting in”.

Answer 36

l’effet de salting est l’augmentation de la solubilité des protéines. Cet effet a lieu a une force ionique de 0 a 0.5 M.

Question 37

Explique pourquoi le “salting in” à lieu.

Answer 37

L’effet du “salting in” vient du fait que les molécules de sel vont se lier directement au protéine et réduit leur net charge. Par conséquent, l’interaction entre protéine va être réduit ce qui affaiblit l’agrégation. De plus, les sels liés aux protéines augmente l’interaction avec l’eau.

Question 38

Une trop haute concentration de sels favorisent quoi?

Answer 38

La précipitation des protéines.

Question 39

Explique pourquoi le “salting out” à lieu.

Answer 39

ce phénomène est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la solvatation (i.e, accès aux molécules d’eau). La séquestration de l’eau résulte en une diminution de la solvatation des protéines

Question 40

Explique la relation entre le salting out et l’hydrophobicité.

Answer 40

• le dessalage est largement une fonction de l’hydrophobicité de la protéine: les régions hydrophobes seront les premières à être moins bien solvatées

Question 41

Récapitule le dessalage de la protéine:

Answer 41

une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine.
- au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules d’eau libres deviennent peu nombreuses.
- Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes
- ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau

Question 42

Quels sont les sels chaotropiques?

Answer 42

Les sels qui se lient et interagissent avec la protéine qui ont un effet déstabilisant

Question 43

À quoi servent les sels optimaux? Donne un autre nom pour ceux-ci.

Answer 43

Ils encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune intéraction avec la protéine

Kosmotropique

Question 44

Dis le max de ce que tu sais sur la série Hofmeister.

Answer 44

Favorisent la précipitation (Strongly hydrated anions): citrate(3-)—>sulfate(2-)—>phosphate(2-)—>F—>Cl—>Br—>I—>NO3—>ClO4: weakly hydrated anions (favorisent la solubilité)

Favorisent la précipitation (Weakly hydrated cations): N(CH3)4—>NH4 —>Cs—>Rb—>K —>Na —>H —>Ca —>Mg —>Al: strongly hydrated cations (favorisent la solubilité)

Question 45

Quel est le sel le plus utilisé dans la précipitation des protéines?Pourquoi?

Answer 45

Le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4

Vu que sa force ionique est élevée et il a une solubilité élevée