Codice genetico e sue proprietà. Sintesi proteica. Flashcards
RIBOSOMI
Caratterizzati da: DUE MACROMOLECOLE di RNA RIBOSOMIALI (rRNA) + PROTEINE = aggregati mediante legami non covalenti, primariamente da legami H
Si trovano nel citoplasma di tutte le cellule, sia procariotiche che eucariotiche (nonostante abbiano differenze dimensionali: i ribosomi eucariotici hanno più DNA e più proteine rispetto a quelli procariotici). Nei procarioti, gli organelli in esame sono liberi, poiché non è presente alcun reticolo endoplasmatico che possa legarli.
Le due subunità asimmetriche dei ribosomi, se osservate al microscopio, si mostrano strutturalmente molto simili.
La frazione:
- maggiore: forma di barca con un’estremità più appuntita;
- minore: formata da una testa + un corpo, legati da un collo più sottile.
Presenti TRE SITI DI LEGAMI per le molecole di tRNA (solo nella frazione più grande):
• A (sito di attacco): qui, l’anticodone del tRNA si lega al codone dell’mRNA, ponendo il proprio amminoacido affianco alla catena polipeptidica che si sta formando;
• P (sito polipeptidico): il tRNA cede il proprio amminoacido alla catena in formazione, nel sito di condensazione;
• E (sito Exit): il tRNA dopo aver ceduto il proprio amminoacido, si posiziona nel sito di distacco, prima di lasciare il ribosoma e ricominciare il ciclo.
DIFFERENZE RIBOSOMI PROCARIOTICI ED EUCARIOTICI
Ribosomi delle cellule procarioti:
- massa ≈ 2700 kDa
- diametro = 20nm
- coefficiente di sedimentazione totale = 70S
- le due frazioni che costituiscono il complesso hanno rispettivamente:
- > 30S = costituita da 21 proteine differenti + UNA molecola di rRNA 16S
- > 50S = formata da 34 proteine + DUE molecole di RNA (5S e 23S)
- 2/3 formati da rRNA
Ribosomi delle cellule eucarioti:
- massa = 4000 kDa
- coefficiente di sedimentazione totale = 80S
- DUE subunità rispettivamente da:
- > 60S = 45 proteine + 3 molecole di rRNA
- > 40S = 33 proteine + UNA molecola di rRNA 18S
- quasi uguale rRNA/proteine
Coefficiente di sedimentazione (indicato con la lettera S, in unità Svedberg) si riferisce alla velocità di sedimentazione nella centrifugazione a ultravelocità.
Ad incidere sul parametro sono un insieme di fattori come peso molecolare, grandezza, peso e forma. Motivo per cui la somma delle due subunità (30S + 50S) non corrisponde al coefficiente totale di 70S.
Una regione piana (piattaforma) nella lieve curvatura della subunità minore, forma un solco in corrispondenza con la depressione della subunità maggiore. Il solco tra le due subunità accoglierà l’mRNA durante la traduzione.
PROPRIETÀ CODICE GENETICO
Insieme delle regole attraverso le quali viene tradotta l’informazione codificata negli acidi nucleici costituenti i geni per la sintesi di proteine nelle cellule.
Per fare le combinazioni necessarie per i 20 (e più) amminoacidi si è scoperto che il codice genetico fosse determinato da 4 lettere (nucleotidi) a gruppi di 3, infatti 4^3 può fare 64 combinazioni (se fossero solo 2 avremmo 4^2 = 16 possibili combinazioni).
• NON sovrapposto: CIASCUN nucleotide fa parte di un SOLO codone
Es. –AGCAUCGCA–
sovrapposto: AGC, GCA, CAU, ecc.
non sovrapposto: AGC, AUC, GCA, ecc.
• DEGENERATO: ad 1 singolo amminoacido può corrispondere + di 1 codone
* 3 codoni su 64 NON codificano, ma sono riconosciuti dal ribosoma come CODONI di TERMINAZIONE (= fine traduzione)
• NON impreciso: nessun codone specifica per più amminoacidi
• UNIVERSALE: presente in tutti gli organismi. Possiamo anche dire che tutti organismi condividono una origine evolutiva comune
DECIFRAZIONE DEL CODICE GENETICO
- Codone: TRIPLETTA di nucleotidi che codifica uno SPECIFICO amminoacido.
- Quadro di lettura: determinato dal primo codone, in base al quale OGNI TRE residui nucleotidici inizia un NUOVO CODONE.
- Traduzione: processo complessivo della SINTESI PROTEICA guidata dall’mRNA.
- Attori: ribosomi (rRNA + proteine accessorie), tRNA, mRNA, amminoacidi, enzimi.
- Dove: CITOSOL per proteine che servono alla cellula; RER per proteine di secrezione.
- Codone di INIZIO/METIONINA: AUG
- Codoni di STOP: UGA, UAA, UAG
MUTAZIONI CODICE GENETICO
Somiglianza nei codoni che specificano lo stesso Am => mutazioni spontanee che causano cambiamenti a livello di singole basi in un gene, spesso non producono cambiamenti nella sequenza Am della corrispondente proteina.
• Mutazione SINONIMA: sostituzione di 1 base azotata in una sequenza di DNA => NON determina variazione della sequenza amminoacidica della proteina interessata
Es. UUU diventa UUC = fenilalanina in entrambi i casi
• Mutazione NON-SINONIMA: sostituzione di 1 base azotata in una sequenza di DNA => determina VARIAZIONE della sequenza amminoacidica della proteina interessata
Es. UUU = fenilalanina; UUA = leucina
• Mutazioni NONSENSO: mutazione ad un nucleotide di 1 tripletta => determina la trasformazione di 1 codone codificante un amminoacido = in un codone di stop
Es. UAU = tirosina; UAA = stop
* Tali mutazioni sono tradotte solo UNA volta prima di essere riconosciute + selettivamente distrutte mediante un processo, detto NONSENSE-MEDIATED DECAY (NMD)
• Mutazioni FRAMESHIFT: delezione o inserzioni di un numero di nucleotidi non divisibile per 3
=> Spostamento della cornice di lettura a valle della mutazione
=> Codificazione di una sequenza amminoacidica non corrispondente a quella del trascritto originario
RUOLO DEGLI RNA TRANSFER (tRNA)
[decodificazione dei codoni]
Traduzione richiede che: informazione codificata nella seq nucleotidica di 1 mRNA -> sia decodificata + utilizzata per dirigere assemblaggio Am in 1 catena polipeptidica.
Decodificazione informazione di mRNA POSSIBILE grazie a tRNA: ADATTATORI nella traduzione del linguaggio degli acidi nucleici -> nel linguaggio delle proteine.
Struttura:
• Piccoli, costituiti da una singola elica di RNA ripiegata a trifoglio
* motivo forma: ci sono seq di nucleotidi complementari
• 70-90 nucleotidi
• Almeno un tipo di tRNA per ciascun Am
ANSA (o braccio):
• dell’AMMINOACIDO (AA): trasporta un aa specifico
• dell’ANTICODONE (AC): seq di 3 nucleotidi centrali (quest’ansa in tot ne ha 7) complementare al codone dell’mRNA
• D: contiene nucleotide inusuale diidrouridina
• TψC (T): contiene ribotimidina (T, di solito assente nell’RNA) e pseudouridina (ψ)
• Le due anse CONTRIBUISCONO alle importanti INTERAZIONI che INFLUENZANO il RIPIEGAMENTO della molecola tRNA
OSCILLAMENTO
[o vacillamento]
- Riconoscimento codone/anticodone grazie all’appaiamento di basi
- Appaiamento antiparallelo: 1 base del codone (letto in direzione 5’-3’) dell’mRNA appaiata con 3a base del tRNA
- Nr dei vari tRNA per ciascun amminoacido NON è lo stesso => non è detto che ci sia 1 tRNA ≠ per ciascun codone che specifica per 1 amminoacido
- Alcuni tRNA contengono nucleotide inosina (I) che contiene ipoxantina, la quale può legarsi con U, C e A con appaiamenti deboli
- G del tRNA può accoppiarsi con U o C dell’mRNA
IPOTESI dell’OSCILLAZIONE (wobble):
• PRIME DUE basi del codone di mRNA formano SEMPRE appaiamenti FORTI + STABILI con tRNA
• PRIMA base dell’anticodone determina SPECIFICITÀ del tRNA
• C o A: legame è SPECIFICO + quel tRNA legge un SOLO codone
• U o G: il legame è MENO specifico + possono essere letti DUE codoni
• I: TRE diversi codoni possono essere letti
• TERZA base permette una più RAPIDA DISSOCIAZIONE del tRNA => AUMENTANDO le VELOCITÀ della sintesi proteica
Es. Risultato vacillamento: 6 codoni per leucina, necessitano SOLO 3 tRNA.
TAPPE GENERALI SINTESI PROTEICA
[o traduzione]
- ATTIVAZIONE degli AMMINOACIDI: caricamento sui RISPETTIVI tRNA
- INIZIO: legame mRNA con
- subunità MINORE del ribosoma e
- tRNA di inizio - ALLUNGAMENTO: della catena nascente polipeptidica mediante UNIONE COVALENTE di UNITÀ AMMINOACIDICHE
- TERMINE + RILASCIO: fine della catena polipeptidica SEGNALATA da SPECIFICI CODONI di terminazione sull’mRNA
- RIPIEGAMENTO + MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI:
- permettono ACQUISIZIONE della FORMA biologicamente ATTIVA alle proteine.
- Rimozione di aa;
- aggiunta gruppi acetile, fosfato, metile ecc.;
- scissione proteolitica della proteina;
- attacco di oligosaccaridi o gruppi prostetici ecc.
ATTIVAZIONE DEGLI AMMINOACIDI
[traduzione]
• Formazione del tRNA caricato con il suo amminoacido
• AMMINOACIL-tRNA SINTETASI (aaRS): enzima che catalizza questa reazione
• Nel citosol, CIASCUNO dei 20 aa => legato covalentemente al tRNA SPECIFICO (utilizzando ATP).
Reazione a due tappe:
1) Energia dell’ATP = usata per ATTIVARE aa attraverso FORMAZIONE di 1 aa ADENILATO legato all’enzima. Trasferimento dell’aa -> alla molecola di tRNA (tappa 2) -> e poi alla catena polipeptidica in crescita
ATP + amminoacido -> amminoacil-AMP + PP(i)
2) Enzima TRASFERISCE il suo aa legato all’estremità 3’ di un tRNA ISOACCETTORE
Amminoacil-AMP + tRNA -> amminoacil-tRNA + AMP
• Questo ATTIVA gr carbossilico dell’aa per FACILITARE formazione legame peptidico
RUOLO DEI RIBOSOMI
[traduzione]
- Ribosoma = è un RIBOZIMA
- DURANTE traduzione, ribosoma va incontro ad 1 ciclo ripetitivo di CAMBIAMENTI MECCANICI = guidati dall’energia rilasciata dall’IDROLISI di GTP
- Ribosoma si muove LUNGO un “NASTRO” di RNA contenente INFORMAZIONI CODIFICATE
- Sono macchine PROGRAMMABILI: info conservata nell’mRNA DETERMINA seq amminoacil-tRNA che ribosoma usa nella traduzione
• Ogni ribosoma ha TRE SITI di ASSOCIAZIONE per molecole RNA TRANSFER:
- sito A (amminoacido);
- sito P (peptidico);
- sito E (exit, di uscita);
ricevono CIASCUN tRNA in PASSAGGI SUCCESSIVI del CICLO di ALLUNGAMENTO.
• tRNA si legano a questi siti => riempiono spazio tra le 2 subunità ribosomiali
Estremità del tRNA legato:
• dell’ANTICODONE:
- contatta subunità MINORE che
- svolge ruolo chiave nella DECODIFICAZIONE delle info contenute nell’mRNA
• che porta AMMINOACIDO:
- contatta subunità MAGGIORE che
- ha ruolo CATALICO nella FORMAZIONE del LEGAME PEPTIDICO
Altre caratteristiche strutturali:
1. INTERFACCIA tra SUBUNITÀ maggiore e minore = forma CAVITÀ relativamente SPAZIOSA: delimitata quasi esclusivamente da RNA.
SUPERFICI delle 2 subunità RIVOLTE una verso l’altra: contengono SITI di LEGAME per mRNA + tRNA in arrivo.
* rivestono grande importanza per funzionamento del ribosoma
- Questa PORZIONE CATALITICA della subunità MAGGIORE: giace in una PROFONDA FENDITURA = PROTEGGE legame PEPTIDICO appena formato dall’IDROLISI (da parte del solvente acquoso).
- mRNA è situato in uno STRETTO CANALE che SCORRE LUNGO subunità MAGGIORE: passando attraverso i siti A, P ed E.
PRIMA di entrare nel sito A: mRNA privato di QUALSIASI struttura SECONDARIA da una ATTIVITÀ ELICASICA del ribosoma. - Una GALLERIA corre ATTRAVERSO tutta subunità MAGGIORE: iniziando dal sito attivo.
Si ritiene che questa galleria FORNISCA una VIA di PASSAGGIO per TRASLOCAZIONE del POLIPEPTIDE in ALLUNGAMENTO attraverso il ribosoma.
INIZIO
[traduzione procarioti]
Ribosoma legato ad 1 mRNA, si muove LUNGO mRNA: da 1 codone -> al successivo = in BLOCCHI CONSECUTIVI di 3 NUCLEOTIDI.
CODONE di INIZIO: sito specifico = specificato come AUG.
Legame a questo codone automaticamente pone ribosoma nell’appropriato MODULO di LETTURA (reading frame): legge correttamente l’intero messaggio da quel punto in poi.
PASSAGGIO 1: SUB. MINORE RIBOSOMA SI PORTA SUL CODONE INIZIO
• mRNA NON si lega a ribosoma INTERO => ma alle SUBUNITÀ maggiore + minore, in fasi separate.
• Passaggio più importante: legame della sub. ribosomale MINORE alla PRIMA (o una delle prime) seq AUG nell’mRNA => serve da codone di inizio
• mRNA batterici possiedono SPECIFICA SEQUENZA di NUCLEOTIDI che si trova da 5-10 nucleotidi PRIMA del CODONE di INIZIO = seq di SHINE-DALGRANO
• Seq di Shine-Dalgrano = COMPLEMENTARE a seq di nucleotidi VICINO all’estremità 3’ dell’RNA RIBOSOMALE 16S della subunità MINORE del ribosoma
=> attacco della subunità 30S al codone d’inizio AUG: risultato dell’interazione tra queste seq complementari sull’mRNA e l’rRNA
Inizio della sintesi RICHIEDE fattori di inizio (= proteine solubili):
• IF = procarioti; eIF = eucarioti
• Procarioti necessitano di TRE fattori d’inizio: IF1; IF2; IF3 - che legano subunità 30S
• IF2 = proteina che lega GTP richiesta per legare PRIMO amminoacil-tRNA
• IF3 = IMPEDISCE che subunità MAGGIORE (50S) si leghi PREMATURAMENTE alla subunità 30S
• IF1 = PROMUOVE ATTACCO della subunità 30S all’mRNA + può IMPEDIRE che aa-tRNA si INSERISCA nel sito ERRATO sul ribosoma
PASSAGGIO 2: PRIMO aa-tRNA SI INSERISCE SUL RIBOSOMA
• AUG non solo codone d’inizio, ma anche l’UNICO codone che specifica la METIONINA = sempre PRIMO amminoacido INCORPORATO all’ESTREMITÀ N-TERMINALE della CATENA polipeptidica NASCENTE
• Nella gran parte dei casi, metionina viene poi RIMOSSA ENZIMATICAMENTE
• Cellule possiedono 2 distinti metionil-tRNA:
1. uno usato per INIZIARE sintesi proteica;
2. l’altro per INCORPORARE residui di metionina all’interno di un polipeptide.
• aa-tRNA iniziatore portato da IF2 nel sito P del ribosoma => dove ANSA dell’anticodone del tRNA LEGA AUG dell’mRNA
* IF1 e IF3 sono rilasciati
PASSAGGIO 3: ASSEMBLAGGIO COMPLESSO D’INIZIO COMPLETO
• Subunità MAGGIORE si unisce al complesso
• GTP legato a IF2 = viene idrolizzato
=> causa cambiamento conformazionale nel ribosoma, richiesto per rilascio di IF2-GDP
INIZIO
[traduzione eucarioti]
• Ribosomi eucariotici contengono:
- rRNA più grandi;
- proteine aggiuntive;
- mRNA eucariotici hanno caratteristiche particolari: cappuccio 5’ + coda 3’.
• Cellule eucariotiche richiedono ALMENO 12 fattori di inizio = per totale di oltre 25 catene polipeptidiche.
• Parecchi eIF (ad es., eIF1, eIF1A, eIF5 ed eIF3) LEGANO subunità 40S => preparandola a legarsi all’mRNA.
• Anche tRNA iniziatore (legato alla metionina) = si attacca alla subunità 40S prima di interagire con mRNA.
• tRNA iniziatore si INSERISCE nel SITO P della subunità MINORE, in associazione con eIF2-GTP.
• Sub. minore del ribosoma + fattori di inizio associati + tRNA caricato = COMPLESSO DI PRE-INIZIO 43S => pronta per cercare estremità 5’ dell’mRNA, che porta il cappuccio di metilguanosina.
• Processo:
- inizialmente indirizzato verso mRNA con aiuto di un gruppo di fattori di inizio già legati all’mRNA;
- Tra questi fattori:
1) eIF4E si LEGA al cappuccio dell’estremità 5’ mRNA;
2) eIF4A si MUOVE lungo estremità 5’ => RIMUOVENDO tutte regioni a doppio filamento che INTERFERIREBBERO con SCORRIMENTO del complesso 43S lungo mRNA;
3) eIF4G serve da COLLEGAMENTO tra: - estremità 5’ incappucciata e
- quella 3’ poliadenilata dell’mRNA.
- CONVERTE mRNA LINEARE => in MESSAGGIO CIRCOLARE.
• Una volta che complesso 43S legato all’estremità 5’ mRNA => SCORRE lungo messaggio FINCHÉ RAGGIUNGE seq riconoscibile di nucleotidi che CONTIENE codone di inizio AUG.
• Quando complesso 43S ha raggiunto codone AUG appropriato:
- GTP legato a eIF2 è idrolizzato e
- subunità maggiore (60S), si unisce al complesso.
• FORMAZIONE ribosoma completo 80S RICHIEDE attività di un’altra proteina (eIF5B) che:
- lega + idrolizza GTP.
• Idrolisi dei 2 GTP + formazione del ribosoma completo => accompagnate dal rilascio di tutti fattori di inizio.
Durante questi eventi, ANTICODONE del tRNA iniziatore RIMANE legato al codone di inizio AUG nel sito P del ribosoma => Complesso è ora pronto per il primo passaggio dell’allungamento.
RIASSUNTO FATTORI DI INIZIO
[traduzione eucarioti]
Traduzione eucarioti = processo è coadiuvato dai fattori eIF (eIF4 spiegato dopo):
• eIF-1 (and 1A): promuove scanning
* eIF-2: lega tRNA iniziatore alla sub. 40S = richiede GTP
• eIF-2B: catalizza idrolisi GTP in GDP
* eIF-3: lega subunità 40S + previene che essa si leghi alla 60S
* eIF-6: lega subunità 60S + previene che essa si leghi alla 40S
• eIF-5: stimola legame tra le subunità 60S e complesso d’inizio 48S
- controparte dei procarioti
• eIF4 eIF4F: - Originariamente isolato per la sua capacità di legare il Cap-nucleotide 7MeGTP. - Composta da 3 subunità: eIF4G – adattatore versatile eIF4A – RNA elicasi eIF4E – si lega direttamente al Cap
eIF4G:
- aiuta reclutamento del complesso di pre-inizio sull’ mRNA;
- può interagire con eIF4E, eIF4A, eIF3, e la poly-A binding protein (Pab1);
- responsabile dell’effetto sinergico che il Cap e la coda di poli(A) hanno sulla traduzione.
Dunque, inizio traduzione eucarioti coinvolge 12 fattori:
- eIF1, eIF1A, eIF5, eIF3 legano subunità 40S
- eIF2 + GTP si lega al met-tRNA
- eIF4E, eIF4A, eIF4G
ALLUNGAMENTO
[traduzione]
Consiste in una SERIE di PASSAGGI che si RIPETE continuamente man mano che gli Am vengono POLIMERIZZATI nella CATENA POLIPEPTIDICA NASCENTE.
PASSAGGIO 1: SELEZIONE AMMINOACIL-tRNA
• Quando tRNA iniziato localizzato al sito P => ribosoma pronto per accettare SECONDO amminoacil-tRNA nel sito A vuoto
• Prima che 2° aa-tRNA possa legarsi all’mRNA sito A = deve combinarsi con: fattore di allungamento proteico legato a GTP
* fattore di allungamento:
- nei procarioti: EF-Tu (o Tu);
- negli eucarioti: eIF1A.
Funzione: necessario per indirizzare aa-tRNA al sito A
• Solo complesso aa-tRNA-Tu-GTP che ha anticodone COMPLEMENTARE al codone dell’mRNA al sito A => INDURRÀ nel ribosoma CAMBIAMENTI conformazionali = necessari a legare tRNA all’mRNA nel SITO di DECODIFICAZIONE
• GTP viene idrolizzato + complesso Tu-GDP rilasciato => lasciando aa-tRNA legato al sito A del ribosoma
* rigenerazione di Tu-GTP dal Tu-GDP rilasciato, richiede altro fattore di allungamento: EF-Ts
PASSAGGIO 2: FORMAZIONE LEGAME PEPTIDICO
• Ora i 2 Am, legati ai rispettivi tRNA, sono giustapposti in una posizione tale che possono reagire l’uno con l’altro.
• Formazione legame peptidico quando:
- gr amminico dell’aa-tRNA situato nel sito A, reagisce con
- gr carbonile dell’Am legato al tRNA del sito P.
Come risultato:
- tRNA legato al 2° codone nel sito A ha 1 peptide attaccato;
- tRNA sito P è DEACILATO.
=> Formazione legame avviene spontaneamente, senza immissione di energia est.
• Reazione catalizzata dalla: PEPTIDIL TRANSFERASI = componente della subunità maggiore del ribosoma.
La sua attività risiede nella molecola di RNA RIBOSOMIALE (sub. maggiore ribosoma) => peptidil transferasi è un RIBOZIMA.
PASSAGGIO 3: TRASLOCAZIONE
• Formazione 1° legame peptidico lascia:
- 1 estremità della molecola tRNA nel sito A ANCORA attaccata al suo CODONE COMPLEMENTARE;
- l’altra estremità della molecola attaccata al DIPEPTIDE.
• tRNA del sito P privo di Am
• Passaggio seguente: TRASLOCAZIONE = caratterizzato da un piccolo MOVIMENTO simile a quello di un CRICCHETTO della sub. MINORE rispetto alla maggiore.
• Come risultato del movimento a scatti: ribosoma si sposta di tre nucleotidi (un codone) lungo I’mRNA in direzione 5’ -> 3’
• Traslocazione è accompagnata da:
- spostamento del dipeptidil-tRNA dal sito A -> al sito P del ribosoma;
- movimento del RNA deacilato dal sito P -> al sito E.
Mentre avvengono questi movimenti, entrambi tRNA restano legati MEDIANTE legami H ai rispettivi CODONI nel mRNA.
• Passaggio intermedio nel processo di traslocazione ha mostrato i tRNA in “stati ibridi” PARZIALMENTE traslocati.
• tRNA occupano siti ibridi A/P e P/E rispettivamente.
• Passaggio da uno stato “classico” non a cricchetto -> a quello ibrido (a cricchetto) avviene spontaneamente => senza coinvolgimento di altri fattori.
• Una volta spintosi nello STATO IBRIDO, FATTORE di ALLUNGAMENTO legato a GTP:
- nei procarioti: EF-G
- negli eucarioti: eEF2
LEGA ribosoma STABILIZZANDOLO nello stato a cricchetto => IMPEDENDO movimento del tRNA indietro verso la conformazione classica A/A e P/P.
• Successivamente, IDROLISI del GTP genera CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE che muove:
- mRNA +
- anse dell’anticodone associate del tRNA
rispetto alla subunità minore:
- posizionando tRNA legati negli stati E/E e P/P,
- lasciando così vuoto il sito A.
• Nello stesso momento, ribosoma è riportato nello stato non cricchetto.
• In seguito a questa reazione, EF-G-GDP si stacca dal ribosoma.
PASSAGGIO 4: RILASCIO tRNA DEACILATO
• tRNA DEACILATO lascia ribosoma, liberando il sito E.
• Per ciascun ciclo di allungamento = almeno DUE molecole di GTP sono IDROLIZZATE:
- 1 durante SELEZIONE dell’amminoacil-tRNA
- 1 durante TRASLOCAZIONE.
• Una volta che peptidil-tRNA spostato sul sito P (mediante la traslocazione) => sito A è ancora una volta libero per far entrare 1 altro amminoacil-tRNA, in questo caso uno il cui anticodone è complementare al terzo codone.
• Una volta che 3° tRNA caricato si è legato all’mRNA nel sito A => dipeptide dal tRNA sito P -> trasferito all’amminoacido sul tRNA sito A:
- formando 2° legame peptidico,
- e quindi un TRIPEPTIDE attaccato al tRNA nel sito A.
• tRNA nel sito P è ancora una volta PRIVO di amminoacido.
• FORMAZIONE legame peptidico, seguita da:
- TRASLOCAZIONE del ribosoma al quarto codone +
- RILASCIO del tRNA deacilato.
• Ciclo è pronto per ricominciare.
TERMINAZIONE
[traduzione]
• TRE dei 64 possibili codoni trinucleotidici funzionano da CODONI di STOP = interrompono formazione del polipeptide, invece di codificare un altro amminoacido.
• NON esiste alcun tRNA i cui anticodoni siano COMPLEMENTARI ai codoni di stop.
• Quando ribosoma raggiunge uno di questi codoni: UAA, UAG o UGA; segnale viene letto in modo da:
- BLOCCARE ogni ulteriore ALLUNGAMENTO +
- LIBERARE POLIPEPTIDE legato all’ultimo tRNA.
• Terminazione RICHIEDE PRESENZA di fattori di rilascio (RF) che possono essere distinti in 3 gruppi:
- RF di classe I = riconoscono codoni di stop nel sito A del ribosoma
- RF di classe II = proteine leganti GTP (proteine G) i cui ruoli non sono ancora ben compresi
• Batteri hanno 2 classi di fattori di rilascio:
- RF1 = riconosce codoni di stop UAA e UAG
- RF2 = riconosce codoni di stop UAA e UGA
• Cellule eucariotiche hanno un RF di classe I, denominato eRF1 = riconosce TUTTI codoni di stop.
• RF di classe I entrano nel sito A del ribosoma, dove 1 tripeptide conservato ad una estremità del fattore di rilascio:
- interagisce direttamente con codone di stop nel sito A e
- induce cambiamento conformazionale critico che agisce su ≠ nucleotidi dell’mRNA della subunità minore.
• LEGAME ESTEREO che lega catena polipeptidica nascente al tRNA => viene quindi IDROLIZZATO;
• POLIPEPTIDE completo è RILASCIATO dal ribosoma.
• A questo punto, IDROLISI del GTP legato all’RF di classe II (RF3 o eRF3) = porta al rilascio dell’RF di classe I dal sito A del ribosoma.
• Passaggi finali della traduzione includono:
- RILASCIO del tRNA deacilato dal sito P,
- DISSOCIAZIONE dell’mRNA dal ribosoma,
- DISASSEMBLAGGIO del ribosoma nelle due subunità maggiore e minore in preparazione ad un nuovo ciclo di traduzione.
• Questi passaggi finali RICHIEDONO una serie di FATTORI PROTEICI => diversi negli eucarioti e nei batteri. Nelle cellule batteriche, tali proteine includono:
- EF-G,
- IF3 e
- RRF (ribosome recycling factor) = promuove separazione delle subunità ribosomali.
