Basi molecolari dell'informazione ereditaria.

Question 1

BASI MOLECOLARI DELLA TRASMISSIONE EREDITARIA

Answer 1

• Identificazione materiale genetico;
• DNA: relazione tra struttura e funzione;
• Meccanismo molecolare della replicazione del DNA;
• Il meccanismo di “riparo” del DNA e sue correlazioni con patologie umane.

Question 2

STUDI CHIMICI

[materiale genetico]

Answer 2

Miescher 1868: Isolamento del materiale contenuto nel nucleo cellulare (la NUCLEINA) dai globuli bianchi del pus di ferite infette e dallo sperma di salmone

Altmann 1889: Definisce il materiale nucleare ACIDO NUCLEICO e perfeziona i metodi di estrazione del DNA in vari tessuti animali e dal lievito

Zacharias e Hertwing 1884: La nucleina è il componente dei cromosomi
=> Chimica dell’acido nucleico e natura dei suoi componenti

Levene 1929: Lo zucchero dei nucleotidi è il 2-desossiribosio
Levene 1931: “Teoria del tetranucleotide”

N.B. Poiché le proteine mostravano una complessità molto maggiore dell’acido nucleico si pensava che le proteine rappresentassero il materiale genetico!

Question 3

CENNI ESPERIMENTI MATERIALE GENETICO

Answer 3

Esperimento di Griffith, 1928
Dimostrazione che il DNA è il materiale genetico.
Pneumococco:
Ceppo virulento S – smooth – liscio (provoca polmonite)
Ceppo NON virulento R – rough – rigido (NON provoca polmonite)

Esperimento di Avery, 1944
L’attività trasformante veniva distrutta da una desossiribonucleasi (DNAasi) pancreatica (un enzima che degrada specificamente le molecole di DNA), mentre l’aggiunta di una ribonucleasi pancreatica (che degrada l’RNA) e di diversi enzimi proteolitici (che degradano le proteine) non aveva alcun effetto sull’attività trasformante.

Esperimento di Hershey e Chase, 1952
Virus con:
32 P -> fosforo radioattivo -> il DNA è radioattivo
=> la radioattività si trova nell’ospite e viene passata alla progenie fagica
35 S -> zolfo radioattivo -> la parte proteica è radioattiva
=> la radioattività si ritrova nelle ombre fagiche e non è passata alla progenie fagica

Si arrivò alla conclusione che è il DNA a contenere il materiale genetico.

Question 4

STRUTTURA TRIDIMENSIONALE DEL DNA

[modello di Watson e Crick]

Answer 4

1. DNA = doppia elica formata da DUE catene polinucleotidiche con avvolgimento DESTRORSO.
2. Basi impilate e giacciono su piani PERPENDICOLARI all’asse della doppia elica.
3. Le due CATENE polinucleotidiche sono UNITE tra loro per mezzo di legami IDROGENO.
4. La molecola è percorsa in tutta la sua lunghezza da due SOLCHI: minore (12 Å) e maggiore (22 Å). Sfasatura delle due catene.
5. Distanza tra i piani delle coppie di basi = 3,4 Å. Ogni giro interno della doppia elica comprende 10 basi: passo dell’elica = 34 Å.
6. Gli atomi di fosforo distano 10 Å dall’asse della molecola. Lo spessore della doppia elica è pari a 20 Å (= 2 nm) in accordo con la distanza calcolata con la diffrazione a raggi X.
7. Base grande (purina) + base piccola (pirimidina) = unico accoppiamento compatibile con lo spessore della doppia elica.
8. Gli appaiamenti possibili dati gli stati tautomerici prevalenti nell’ambiente intracellulare sono A = T e G ≡ C (A/T = 1; G/C = 1). La stabilità termica sarà tanto maggiore quanto maggiore è il contenuto in G ≡ C del DNA.
9. Le due catene sono ANTIPARALLELE. La sequenza di basi di una emielica è determinata dalla sequenza di basi dell’elica opposta: A+T/G+C rappresenta il rapporto di asimmetria tra le due eliche.

Question 5

LIVELLI DI CONDENSAZIONE DELLA CROMATINA

Answer 5

1. Al livello più semplice abbiamo il DNA a doppia elica.
2. DNA + istoni = formano complesso detto NUCLEOSOMA
3. Ogni nucleosoma consiste in 8 proteine di istoni attorno alle quali si avvolge il DNA facendo 1,65 giri.
4. CROMATOSOMA = nucleosoma + istone H1
5. 1° livello: FIBRA di cromatina DA 10 nm, “collana di perle” dove si vedono gli istoni separati dal DNA linker
6. 2° livello: nucleosomi si COMPATTANO grazie ad una serie di variazioni strutturali note come MODELLO A ZIG-ZAG, formando una FIBRA DA 30 nm.
7. Questa fibra forma delle anse tenute alla base di uno scheletro (SCAFFOLD) da alcune PROTEINE. Questo è il 3° livello: FIBRA DA 300 nm.
8. 4° livello: la cromatina si compatta e si SUPERAVVOLGE formando FIBRA DA 700 nm che corrisponde al diametro dei singoli cromatidi.
9. 5° livello: FIBRA DA 1400 nm. Livello CONDENSAZIONE MAX, quello dei CROMOSOMI METAFISICI.

Question 6

CROMATINA

Answer 6

• Forma in cui gli ac. nucleici si trovano nella cellula
• Si trova negli eucarioti
• Costituita da: DNA + Proteine (istoni)
• Unità base: NUCLEOSOMA -> OTTAMERO di istoni 2x (H2A, H2B, H3, H4) + circa 200 coppie di nucleotidi di DNA
• CROMATOSOMA = nucleosoma + istone H1

Funzioni:

• Impacchettamento del DNA;
• Rafforzare il DNA per permettere la meiosi;
• Prevenire danni al DNA;
• Controllare replicazione DNA ed espressione gene.

Question 7

FIBRA DA 10 nm

Answer 7

L’ottamero istonico forma un disco: ISTONI CORE
A questi istone di avvolge un DNA che ha 146 paia di basi: DNA CORE
Quindi, ISTONI + DNA CORE = NUCLEOSOMA

Tra un nucleosoma e l’altro esiste il DNA LINKER, composto da 20 - 60 paia di basi.

DNA:
• ATTIVO = o nudo o nella fibra da 10 nm
Avvengono processi come: l’espressione genica (trascrizione), replicazione, ricombinazione.
• INATTIVO = fibra da 30 nm

Istoni -> presentano: HISTONE FOLD DOMAIN = composto da 3 α-eliche.
H3 / H4 = forma di un TETRAMERO
H2A / H2B = sono più stabili in soluzione come ETERODIMERO

Il folding succede SOLO in presenza del DNA, il quale:

• si avvolge prima da H3 e H4 (tetramero)
• e poi H2A e H2B

Dopo la formazione del nucleosoma, esistono delle CODE ISTONICHE (caratteristica degli istoni): regioni N-terminali non strutturate che sporgono dal nucleosoma (in totale: 8 code).
Importanti perché: sono zone NON STRUTTURATE, quindi abbastanza libere => oggetto di modificazioni chimiche durante le MODIFICAZIONI EPIGENETICHE: modificazioni di natura chimica, durante le quali esistono enzimi che legano / rimuovono gr chimici in queste zone degli istoni.

Le CODE sono il SITO di MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI che alterano la funzione dei singoli nucleosomi. Le modifiche comprendono:

• FOSFORILAZIONE (sulla serina)
• ACETILAZIONE (sulla lisina)
• METILAZIONE (sulla arginina)

Tra DNA e istoni: 14 punto di contatto => 40 legami H (SOLCO MINORE - interazioni NON specifiche)

Nucleosoma:
interno -> ricco di A+T
esterno -> ricco di G+C

Question 8

FIBRA DA 30 nm

Answer 8

È presente l’istone H1 in SINGOLA COPIA ed interagisce con il DNA LINKER
=> aumenta ANGOLO con cui il DNA gira intorno all’ottamero istonico
=> aumenta il COMPATTAMENTO del DNA

Istone H1 rende la fibra MENO accessibile a molti enzimi che dipendono dal DNA (Es. RNA-polimerasi)

Due ipotesi:

1. Fibra a forma di solenoide:
   - 6 solenoidi per giro,
   - DNA linker (più corto) NON passa per il centro della fibra
2. Fibra a zig-zag:
   - 2 nucleosomi per giro,
   - DNA linker (più lungo) passa per il centro

Livelli superiori di cromatina: non c’è un’idea precisa, ma si pensa che la MAGGIOR parte del DNA sia impacchettato in ANSE.

La fibra da 30 nm forma anse che sono ANCORATE ad una IMPALCATURA di natura PROTEICA.

Question 9

COMPATTAMENTO DEL GENOMA

Answer 9

A differenza dei procarioti -> DNA negli eucarioti NON è “nudo”, ma associato ad alcune proteine (gli ISTONI) per formare fibre di cromatina (cromatina = DNA + proteine).

Questo accade per un motivo tipicamente strutturale:
- tipica cellula umana ≈ 6 miliardi di paia di basi,
- condensate in soli 46 cromosomi
- una molecola di DNA = lunghezza di 2 metri,
=> è necessario ottimizzare lo spazio.
È per questo che il DNA viene compattato e associato agli istoni.

Le proteine istoniche sono PROTEINE BASICHE, perché ricche di Lisina e Arginina, quindi si associano facilmente al DNA, che è CARICO NEGATIVAMENTE (= presenza dei gruppi fosfati): in tal modo, si formano subunità ripetute dette NUCLEOSOMI.

Ciascun nucleosoma contiene una particella centrale (CORE) = 146 coppie di basi di DNA superavvolto che gira per ≈ 2 volte intorno a un complesso a forma di DISCO (formato da 8 molecole di istoni - 2 ciascuna: H2A, H2B, H3, H4 - cariche +).
Il primo livello di organizzazione, quindi, è quello della “collana di perle”, in cui c’è un susseguirsi di nucleosomi. Questo permette un livello di compattamento di 7 volte maggiore, rispetto al DNA “nudo”.
Da notare che le CODE di ciascun istone (ogni segmento N - terminale + segmento C - terminale di H2A) sono esposte all’ESTERNO, disponibili ad eventuali modifiche.

Oltre alle proteine istoniche, ci sono anche proteine non istoniche coinvolte in processi come la duplicazione del DNA o la trascrizione.
Le proteine, in generale, si legano ogni 200 paia di basi e l’istone H1 (ISTONE DI CONNESSIONE), che si lega al DNA linker (unisce 2 particelle centrali - core - successive), contribuisce a formare una struttura a fibre di 30 nm, che compattano il materiale genetico per più di 40 volte. Questo forma le anse radiali, o DOMINI AD ANSA.

Massimo compattamento del DNA si ha con i cromosomi, in particolare con quelli in metafase:
- consistono in 2 bastoncelli, ossia i CROMATIDI FRATELLI,
- legati a livello del CENTROMERO.
Cromatidi fratelli = contengono le STESSE informazioni genetiche, dato che durante la divisione uno segrega in una cellula e l’altro in un’altra cellula.

Question 10

ETEROCROMATINA ED EUCROMATINA

Answer 10

Nel nucleo di una cellula che non si sta dividendo (interfase) notiamo:

• Eterocromatina:

• Livelli più compatti di organizzazione
• Cromatina che rimane condensata durante l’interfase (rappresenta ≈ 10% di tutta la cromatina)
• caratterizza le zone più dense e scure,
• nella periferia del nucleo (spesso in prossimità della lamina nucleare).
• motivo: regioni che contengono fattori che promuovono l’inibizione della trascrizione
• Spiralizzazione massima = NON permette alle informazioni genetiche contenute in quei punti di essere trascritte (attività trascizionale ridotta o nulla)
• importante a livello dei centromeri o dei telomeri, dove sono presenti numerose sequenze ripetute (pochi geni)
• I geni presenti sull’eterocromatina: NON vengono espressi

L’eterocromatina è: dinamica+ tende ad essere ereditata dalla progenie di una cellula

Due categorie:
1. Costitutiva
- se rimane SEMPRE estremamente compattata (ergo, permanentemente INATTIVA)
- DNA altamente ripetuto + pochissimi geni
Es. centromeri e telomeri, dove NON c’è NECESSITÀ di CODIFICARE per alcun tipo di informazione genetica (anche braccio distale del cromosoma Y)

2. Facoltativa
   - condensata o no, a seconda delle esigenze della cellula - condensata solo in ALCUNE fasi della vita dell’organismo o in certi tipi di cellule
   - porzioni di cromatina temporaneamente inattivate
   Es. Corpo di Barr (riatt. prima della meiosi)

• Eucromatina:

• Rappresentata dalla fibra a 10 nm
• Durante l’interfase ritorna ad uno stato disperso + attivo
• forma leggermente impacchettata di cromatina (DNA, RNA e proteine)
• ricca di geni ed è spesso, ma non sempre, sotto trascrizione attiva.
• comprende la parte più attiva del genoma all’interno del nucleo della cellula
• quando un gene, per ad es. traslocazione, si sposta dall’EUcromatina -> ETEROcromatina, non viene più espresso = si dice SILENTE

Question 11

CORPO DI BARR

Answer 11

Gli organismi di sesso maschile e femminile = corredo genetico uguale, TRANNE che per i cromosomi sessuali: donne XX / uomini XY.
Cromosoma Y = contiene poche sequenze che codificano per RNA o proteine;
Cromosoma X = ne è ricco.
Affinché gli organismi di sesso femminile non abbiano uno squilibrio genetico, durante l’evoluzione, UNO dei 2 cromosomi X delle cellule SOMATICHE si SILENZIA, compattandosi completamente e dando vita al cosiddetto CORPO DI BARR (= eterocromatina facoltativa).
Tuttavia, nei gameti non può inattivarsi (causerebbe la mancata espressione dei geni legati al sesso nello zigote). Quindi, il corpo di Barr si attiva solo in questo caso.

Question 12

VARIAZIONI DELLO STATO DI CROMATINA

Answer 12

Molte modalità di variazione della cromatina si basano sulle modifiche delle code degli istoni (caratterizzate dalla presenza degli amminoacidi), che escono fuori dal nucleosoma.

Due modi per influenzare la struttura + funzione della cromatina:
1. I residui modificati servono come SITO D’ANCORAGGIO per un GRUPPO specifico di proteine NON istoniche = determina le proprietà e l’attività di un dato segmento di cromatina.

2. I residui modificati ALTERANO la modalità di INTERAZIONE con altri segmenti.

Variazioni di questo tipo possono anche portare a cambiamenti dei livelli superiori di organizzazione della cromatina.
Es. l’ACETILAZIONE di un residuo di lisina
in POSIZIONE 16 dell’istone H4
interferisce con la sua interazione con
una molecola H2A di un nucleosoma adiacente,
inibendo la formazione della fibra cromatinica di 30 nm.

C’è, quindi, una forte CORRELAZIONE fra:
- modificazione di un residuo amminoacidico e
- la funzione
Es. un residuo di lisina
in posizione 9 dell’istone H3
è METILATO nei domini ETEROcromatici e
ACETILATO nei domini EUcromatici,
perciò la rimozione o l’aggiunta di gruppi acetile
dagli istoni H3 ed H4
determina la conversione da eucromatina -> eterocromatina.

Question 13

RIMODELLAMENTO CROMATINA

Answer 13

Avviene attraverso “nucleosoma remodelling complex” che sono complessi che contengono molte proteine e questi servono ad AUMENTARE / DIMINUIRE l’ASSOCIAZIONE tra DNA e NUCLEOSOMI.

Le attività che consentono quest’azione sono:

• SCIVOLAMENTO della posizione del nucleosoma rispetto al DNA sino a “liberare” la zona di DNA che deve essere trascritta;
• TRASFERIMENTO: facilitato dal complesso;
• SCAMBIO DIMERO (varianti nucleosomiche).

Question 14

IPOTESI DELLE REPLICAZIONE DEL DNA

Answer 14

Filamenti della doppia elica = tenuti insieme da legami H tra le basi
Presi singolarmente, i legami H = DEBOLI + vengono facilmente rotti
Watson e Crick -> ipotizzarono che la duplicazione avvenisse per SEPARAZIONE GRADUALE dei 2 filamenti della doppia elica = dovuta alla rottura in successione dei legami H (come le 2 metà di una cerniera)
I DUE filamenti sono COMPLEMENTARI tra loro = ognuno ottiene l’informazione necessaria per la costruzione dell’altro filamento
=> una volta separati, OGNUNO può AGIRE DA STAMPO per dirigere l’ASSEMBLAGGIO dei nucleotidi necessari per:
- formare il filamento complementare e
- riportarsi alla condizione di doppia elica

Tre ipotesi della replicazione:
SEMICONSERVATIVA: ogni doppia elica figlia riceve un filamento della struttura parentale. Ciascuna delle doppie eliche figlie è composta da un filamento:
- INTERO derivato dalla doppia elica parentale +
- COMPLETO di nuova sintesi

CONSERVATIVA: i due filamenti originali rimangono insieme (dopo essere serviti da stampo) e altrettanto succede ai due filamenti neosintetizzati.

DISPERSIVA: l’integrità di ognuno dei due filamenti parentali di DNA va persa. Ogni filamento è una combinazione di DNA vecchio e nuovo.

Question 15

ESPERIMENTO DI CENTRIFUGAZIONE DEL DNA MARCATO CON 14 N O 15 N SU GRADIENTE CsCl (cloruro di cesio)

Answer 15

ESPERIMENTO DI CENTRIFUGAZIONE DEL DNA MARCATO CON 14 N O 15 N SU GRADIENTE CsCl (cloruro di cesio)
Il DNA è stato:
- estratto dai batteri,
- mescolato con una soluzione concentrata di CsCl,
- trasferito in una provetta da centrifuga e
- centrifugato fino all’equilibrio.
Durante la centrifugazione, i frammenti di DNA all’interno della provetta si posizionano nel punto in cui la DENSITÀ del Cs è UGUALE alla LORO DENSITÀ, che a sua volta dipende dal rapporto di 15N/14N presente nei loro nucleotidi.
Maggiore è il contenuto di 14N, più in alto nella provetta si troverà il frammento del DNA al termine della centrifugazione.

Risultato esperimento:
LA DUPLICAZIONE DEL DNA AVVIENE CON MODALITÀ SEMICONSERVATIVA (Meselson e Stahl, 1958)
Al momento della replicazione, i due filamenti della doppia elica si separano grazie alla rottura dei legami a H tra le basi appaiate. Ciascun filamento può così funzionare come stampo per la sintesi di un nuovo filamento a esso complementare, utilizzando i desossiribonucleotidi (monomeri del DNA) liberi nella cellula.

Questo esperimento dimostrò che la REPLICAZIONE del DNA è SEMICONSERVATIVA, cioè che ognuna delle due molecole figlie di DNA è costituita da:

• un filamento del DNA parentale (conservativo) e da
• un filamento sintetizzato ex novo.

Question 16

MECCANISMO MOLECOLARE DELLA DUPLICAZIONE DEL DNA

Answer 16

Questa reazione di CONDENSAZIONE richiede ENERGIA = procurata dalla ROTTURA di 2 legami fosfatici appartenenti ai tre gruppi fosfato di cui sono composti i nucleosidi che arrivano.

La molecola di DNA:

• CONTIENE l’informazione necessaria per la propria duplicazione,
• ma MANCA della capacità di realizzarla: DNA polimerasi.

Question 17

DNA POLIMERASI

Answer 17

Tutte le DNA polimerasi (sia in procarioti che eucarioti) hanno le prossime caratteristiche:

1. Non sono in grado di iniziare la sintesi di un filamento di DNA de novo:
   Molecola di DNA circolare a SINGOLO filamento NON può essere utilizzata da stampo perché l’enzima DNA polimerasi NON è CAPACE di INIZIARE la formazione di un filamento DNA.
2. Hanno bisogno di un filamento di DNA stampo da copiare:
   I filamenti di DNA aggiunti di partenza funzionavano da STAMPO per la reazione di polimerizzazione.
   DNA a DOPPIO filamento INTEGRA, non era in grado di consentire l’incorporazione dei precursori marcati. I filamenti dell’elica devono essere SEPARATI perché AVVENGA la REPLICAZIONE.
3. Sono capaci di sintetizzare DNA solo in direzione 5’ -> 3’
4. Hanno bisogno di un’estremità 3’ -OH a cui attaccare i nucleotidi entranti (PRIMER o innesco):
   L’enzima non può sintetizzare filamenti de novo: può solo AGGIUNGERE nucleotidi all’estremità 3’ ossidrilica di un filamento già esistente.

ATTENZIONE: DNA polimerasi III = principale enzima responsabile della replicazione

Question 18

FORCELLA DI REPLICAZIONE

Answer 18

PUNTI in cui la COPPIA di segmenti REPLICATI si INCONTRA + si UNISCE ai segmenti NON replicati.

Ogni forcella di replicazione corrisponde ad un punto in cui:

1. doppia elica PARENTALE va incontro alla SEPARAZIONE dei filamenti;
2. NUCLEOTIDI vengono INCORPORATI nei filamenti complementari NEOSINTETIZZATI.

Le due forcelle di replicazione si muovono in direzione opposta, si dice quindi che la replicazione è BIDIREZIONALE.

Question 19

REPLICAZIONE SEMIDISCONTINUA

Answer 19

Direzione assemblaggio FILAMENTI NEOSINTETIZZATI: 5’ -> 3’
Direzione ambedue molecole di POLIMERASI: 3- -> 5’ (lungo lo stampo); si assembla un filamento che parte dall’estremità 5’ - P.

Direzione crescita 2 filamenti neosintetizzati:
1. in direzione della forcella di replicazione (punto dove i 2 filamenti di DNA si separano): sintetizzato per aggiunta di nucleotidi alla sua estremità 3’;
2. cresce in direzione opposta alla forcella: sintetizzato in modo DISCONTINUO, cioè in frammenti (detti FRAMMENTI di OKAZAKI).
Nel secondo caso, iniziata la sintesi:
- ogni frammento cresce allontanandosi dalla forcella di replicazione
- verso l’estremità 5’ di un frammento formato in precedenza
- al quale viene successivamente legato (attraverso l’enzima DNA LIGASI)

Filamento sintetizzato in modo:

• continuo, detto filamento GUIDA: sintesi continua via via che la forcella di replicazione avanza;
• discontinuo, detto filamento IN RITARDO (o LENTO): l’inizio della sintesi di ogni frammento deve aspettare che i filamenti parentali si separino + espongano aggiuntive porzioni stampo.

Vengono sintetizzati contemporaneamente => termini “guida” e “in ritardo” NON adatti.
Poiché un filamento viene sintetizzato in modo continuo e l’altro in modo discontinuo => detta REPLICAZIONE SEMIDISCONTINUA.

L’avvio della sintesi dei 2 filamenti NON si deve alla DNA polimerasi, MA ad una PARTICOLARE RNA POLIMERASI chiamata PRIMASI (dnaG) => costruisce un piccolo primer costituito di RNA (all’estremità 5’) che serve per la sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi.
Primer di RNA vengono successivamente rimossi -> intervalli che si formano sul filamento, vengono riempiti con DNA -> saldati da parte della DNA ligasi

Riassunto sintesi DNA sul filamento ritardato:

1. Sintesi del primer da parte della PRIMASI
2. Allungamento da parte della DNA POLIMERASI III
3. Rimozione del primer + riempimento dell’interruzione da parte della DNA POLIMERASI I
4. Fusione dei filamenti da parte della DNA LIGASI

• possibile che la probabilità che avvengano ERRORI sia MAGGIORE all’INIZIO della sintesi piuttosto che durante l’allungamento della catena
  => l’uso di un breve segmento di RNA rimovibile evita l’inclusione di basi erroneamente appaiate

Question 20

MECCANISMO A LIVELLO DELLA FORCELLA REPLICATIVA

Answer 20

Aspetti cruciali della replicazione:

• svolgimento del DNA duplex in singoli filamenti;
• mantenimento del DNA nella forma a singolo filamento.

Due enzimi sono necessari per il DNA a doppio filamento nello stato a singolo filamento:
1. ELICASI (dnaB):
Richiede energia fornita dall’IDROLISI dell’ATP per:
- muoversi lungo uno dei filamenti di DNA,
- consente di rompere i legami H che tengono uniti i 2 filamenti,
- esponendo lo stampo di DNA a singolo filamento.
Costituita da 6 subunità assemblate -> proteina a forma d’ANELLO -> circonda un singolo filamento di DNA

2. Proteine SSB (proteine che legano il singolo filamento):
   - stabilizzano il DNA nella condizione a singolo filamento: legano selettivamente il DNA (a singolo filamento), mantenendolo in uno stato disteso ed impedendogli di riavvolgersi o danneggiarsi
   - si legano in modo cooperativo al DNA = il legame di una proteina SSB rende molto più facile il legame della successiva

Nella cellula l’APERTURA dei due filamenti di DNA, il RIVESTIMENTO del DNA con le SSB e la REPLICAZIONE del DNA procedono contemporaneamente.

1. Sintesi del primer da parte della PRIMASI
Nei batteri (si associano temporaneamente formando un complesso): primasi + elicasi = PRIMOSOMA
- elicasi: si muove lungo lo stampo del filamento in ritardo, senza mai essere rilasciata dallo stampo
- primasi: lega elicasi a intervalli regolari e sintetizza i brevi primer RNA (che poi inizieranno la sintesi dei frammenti di Okazaki)

2. Allungamento da parte della DNA POLIMERASI III
   Gli RNA primer vengono poi allungati dalla DNA polimerasi III.
   STESSA molecola di DNA polimerasi III sintetizza SUCCESSIVI frammenti sul filamento in ritardo.
   DUE polimerasi lavorano come se fossero parti dello STESSO complesso proteico.
   Per mantenere lo stesso orientamento del filamento guida: DNA stampo del filamento lento si ripiega ad occhiello (ansa).
3. Rimozione del primer + riempimento dell’interruzione da parte della DNA POLIMERASI I
4. Fusione dei filamenti da parte della DNA LIGASI

Question 21

STRUTTURA DNA POLIMERASI

Answer 21

• DNA polimerasi III (= è la REPLICASI)
- Enzima molto grande composto da varie subunità
- Funzione: opera nella FORMAZIONE del filamento DNA durante REPLICAZIONE
- Parte di un grande complesso chiamato OLOENZIMA DNA POLIMERASI III (= nucleo catalitico + 7 subunità)
- Termine per identificare il complesso di proteine attive alla forcella di replicazione:
REPLISOMA = oloenzima DNA polimerasi III + elicasi + SBB + primasi
- Subunità NON catalitiche dell’oloenzima, detta PINZA β = funzione: mantenere la polimerasi associata al DNA stampo

DNA / RNA polimerasi devono possedere 2 qualità in contrasto tra loro:
1. rimanere ASSOCIATE allo stampo per LUNGHI TRATTI = per poter SINTETIZZARE filamento completamente CONTINUO
2. NON essere attaccate così SALDAMENTE da essere incapaci di spostarsi da un nucleotide al nucleotide successivo
=> Proprietà dovute a: 1 coppia di subunità β -> formano una struttura a CIAMBELLA attraverso cui passa la molecola di DNA
Due subunità β, descritte come una PINZA SCORREVOLE = permette all’enzima di spostarsi da un nucleotide al successivo senza abbandonare lo stampo

Polimerasi sul filamento:
GUIDA: legata ad una singola pinza β
LENTO:
- completa la sintesi di un frammento di Okazaki
- polimerasi si libera dalla pinza β
- viene riciclata su una nuova pinza β = posizionato più vicino alla forcella di replicazione

Assemblaggio della pinza β attorno al DNA = richiede un CARICATORE della PINZA (a più subunità; è parte dell’oloenzima DNA polimerasi III)
Quando legato all’ATP:
- caricatore si LEGA ad una GIUNZIONE primer-stampo
- ARRESTANDO pinza β in una conformazione APERTA
- DNA passa attraverso l’apertura
- ATP legato al caricatore si idrolizza
- si ha il rilascio della pinza che si chiude attorno al DNA
- pinza β, quindi, pronta per legare DNA polimerasi III

• DNA polimerasi I

• Una singola subunità
• Funzione: partecipa principalmente alla RIPARAZIONE del DNA (corregge sue parti danneggiate) + principale enzima che RIMUOVE gli RNA primer all’estremità 5’ di ogni frammento Okazaki e sostituisce con DNA
• Unica DNA polimerasi con ATTIVITÀ ESONUCLEASICA 5’ -> 3’
• motivo per cui possiede la capacità di iniziare la replicazione a livello di un nick (taglio su un solo filamento) nel DNA

Question 22

ATTIVITÀ ESONUCLEASICHE DELLA DNA POLIMERASI

Answer 22

Attività esonucleasica DNA polimerasi I = in grado di DEGRADARE un polimero di DNA rimuovendo uno o più nucleotidi dall’estremità della molecola.

Azione esonucleasica FORTEMENTE in CONTRASTO con quella di sintesi del DNA.

Esistono esonucleasi 5’ -> 3’ ed esonucleasi 3’ -> 5’: a seconda della DIREZIONE in cui il filamento viene DEGRADATO

DNA polimerasi I ha:
- capacità di polimerizzare
- attività esonucleasiche 3’ -> 5’
- attività esonucleasiche 5’ -> 3’
Queste 3 attività corrispondono a 3 ≠ domini di un unico polipeptide => DNA polimerasi I è contemporaneamente 3 enzimi differenti

Maggior parte delle nucleasi specifica per DNA o RNA, ma: l’ESONUCLEASI 5’ -> 3’ della DNA polimerasi I può DEGRADARLI entrambi

Processo:

• PRIMASI lascia un TRATTO di RNA all’estremità 5’ di OGNI frammento di Okazaki
• viene RIMOSSO dall’attività ESONUCLEASICA 5’ -> 3’ della DNA polimerasi I
• dopo questo, l’attività POLIMERASICA consente di RIEMPIRE con desossiribonucleotidi l’INTERVALLO formatosi
• ULTIMO desossiribonucleotide aggiunto LEGATO covalentemente dalla DNA LIGASI

Question 23

ALTA FEDELITÀ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA

Answer 23

SOPRAVVIVENZA di un organismo -> DIPENDE dall’accurata DUPLICAZIONE del suo GENOMA
Errore durante:
- sintesi dell’mRNA (da parte di una RNA polimerasi): provoca sintesi di proteina difettosa
Però, molecola di mRNA = stampo a vita breve -> ne deriva un PICCOLO DANNO di breve durata
- replicazione del DNA: provoca una MUTAZIONE PERMANENTE + probabile eliminazione della progenie di quella cellula

Probabilità di errore da parte dell’apparato replicativo è 10^-9 (un nucleotide su un miliardo)
=> TASSO di MUTAZIONE SPONTANEA in un batterio è in media di UN errore ogni 100 cicli replicativi !!!

INCORPORAZIONE di un nucleotide all’ESTREMITÀ di un filamento in crescita DIPENDE da: CAPACITÀ del nucleoside 3-P entrante di FORMARE con nucleoside del filamento stampo -> coppia di basi accettabile
A-T e G-C = geometria quasi identica tra loro (distanza atomi + angolo legame) => qualsiasi deviazione determina ≠ geometria
Quest’attività è svolta da DNA polimerasi: discrimina tra 4 ≠ potenziali precursori (nucleosidi trifosfato) -> quello in grado di alloggiarsi CORRETTAMENTE nel SITO ATTIVO dell’enzima -> produce coppie di basi A-T o G-C
L’enzima RICONOSCE il nucleotide entrante, e se l’appaiamento di basi ha geometria:
- corretta = cambiamento conformazionale dell’enzima -> le “dita” della polimerasi RUOTANO verso il “palmo” AFFERRANDO il nucleotide entrante -> enzima catalizza l’incorporazione del nucleotide nel filamento in crescita
- errata = sito attivo NON assume la conformazione richiesta per la catalisi -> nucleotide sbagliato NON viene incorporato
* a volte capita che si incorpori un nucleotide sbagliato formando, quindi, coppie di basi ≠ da A-T e G-C => appaiamento errato avviene una volta ogni 10^5 - 10^6 nucleotidi incorporati
Notiamo che questa frequenza è 10^3 - 10^4 volte MAGGIORE del tasso di mutazione spontanea (10^-9) -> com’è possibile?

MOTIVO PER CUI IL TASSO NORMALE DI MUTAZIONE SI MANTIENE COSÌ BASSO:
attività esonucleasica 3’ -> 5’
DNA polimerasi I incorpora nucleotide errato -> nuova estremità ha maggiore TENDENZA a SEPARARSI dallo stampo + FORMARE estremità 3’ a singolo filamento => quest’ultimo entra nel SITO ESONUCLEASICO
In seguito all’incorporazione di nucleotide sbagliato -> polimerasi si FERMA in quel punto -> fornendo il tempo necessario perché l’ESONUCLEASI 3’-5’ RIMUOVA nucleotide appaiato male (prima che il filamento continui ad allungarsi)
Attività esonucleasica 3’-5’: tra le più importanti attività enzimatiche + mette in evidenza la raffinatezza del meccanismo molecolare biologico
Funzioni:
1. Lavoro di CORREZIONE DI BOZZE: rimuove ≈ 99 su 100 basi appaiate male => aumentando la fedeltà di replicazione a 10^-7 - 10^-8
2. Permette anche di operare un meccanismo di RIPARAZIONE DELL’APPAIAMENTO SCORRETTO:
- entra in azione dopo la replicazione
- corregge quasi tutti gli appaiamenti scorretti che sfuggono alla correzione di bozze
* tutti questi processi riducono il tasso di errore a ≈ 10^-9

Riassumendo, la fedeltà della replicazione del DNA è dovuta a TRE attività DISTINTE:

1. accurata selezione dei nucleotidi
2. immediata correzione di bozze
3. riparazione post-replicativa dell’appaiamento errato

Question 24

MOTIVO CRESCITA DEL DNA IN DIREZIONE 5’ -> 3’

Answer 24

I nucleotidi non possono essere aggiunti all’estremità fosfato (5’) perché la DNA polimerasi può aggiungere solo nucleotidi di DNA in una direzione da 5’ a 3’ (quindi li aggiunge all’estremità 3’). Questo perché in caso contrario, cioè di un’ipotetica crescita del filamento 3’-5’, dopo la correzione (dove viene rimosso un nucleotide) la reazione non procederebbe poiché non verrebbe spezzato nessun legame ad alta energia; a differenza del reale processo di crescita del filamento 5’-3’ in cui viene tagliato un legame ad alta energia che fornisce l’energia per la polimerizzazione.

Question 25

PROBLEMA DELLA SEPARAZIONE DEI FILAMENTI DI UNA MOLECOLA DNA CIRCOLARE A DOPPIA ELICA

Answer 25

Questo è uno dei principali problemi topologici.
Srotolamento = processo della separazione dei filamenti di una doppia elica
Prendiamo in considerazione due casi:
1. solo una delle estremità è attaccata ad un gancio
Separazione dei filamenti sarebbe accompagnata dalla ROTAZIONE dell’INTERA fibra poiché essa si OPPONE allo sviluppo della TENSIONE.
Porzione non separata -> diventa avvolta strettamente

2. anche l’altra estremità è attaccata al muro
   Separazione dei filamenti -> genererebbe MAGGIORE stress torsionale -> renderebbe parte non separata PIÙ strettamente avvolta

Separazione filamenti DNA circolare = analoga alla condizione della molecola lineare attaccata al muro (2° caso) - TENSIONE che si sviluppa nella molecola NON può essere RILASCIATA dalla sua ROTAZIONE
Molecola di DNA diventa SUPERAVVOLTA POSITIVAMENTE: di conseguenza, movimento della forcella replicativa = genera superavvolgimenti positivi nella porzione non separata del DNA a monte della forcella

Cellule possiedono enzimi, detti TOPOISOMERASI: possono cambiare lo stato di superavvolgimento in una molecola di DNA
Es. DNA GIRASI = topoisomerasi II, in grado di ELIMINARE stress torsionale che si genera DURANTE replicazione. Svolge quest’attività:
- tagliando ambedue filamenti del duplex di DNA
- facendo passare dall’altra parte un segmento del DNA (attraverso un punto di rottura del doppio filamento)
- in fine, saldando le rotture
* processo guidato dall’ENERGIA rilasciata dall’IDROLISI dell’ATP

Question 26

SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA

Answer 26

DNA superavvolto rispetto al DNA rilassato:

• è più compatto
• occupa meno volume
• si muove più rapidamente (se sottoposto ad una forza centrifuga o campo elettrico)

Quando abbiamo… = si dice…
1) 10 coppie di basi per giro d’elica = molecola RILASSATA

2) > 10 coppie di basi per giro d’elica = MINOR grado di avvolgimento = superavvolgimento NEGATIVO (“sottoavvolto”)
3) < 10 coppie di basi per giro d’elica = MAGGIOR grado di avvolgimento = superavvolgimento POSITIVO (superavvolto)

Definiti TOPOISOMERASI - enzimi che cambiano la TOPOLOGIA del DNA: introducono nel DNA ROTTURE TRANSITORIE a singola / doppia elica; determinano l’aumento / diminuzione del GRADO di DISAVVOLGIMENTO del DNA
TOPOISOMERASI I
- Effettuano rotture transitorie a SINGOLA elica nel DNA,
- consentendo all’elica NON tagliata di passare attraverso la rottura prima di chiudere il nick.
- NON richiedono energia (ATP)
Funzione: essenziali nella replicazione del DNA + trascrizione per prevenire lo sviluppo di eccessivo superavvolgimento

TOPOISOMERASI II
- Effettuano interruzioni transitorie a DOPPIA elica nel DNA,
- passano il DNA NON tagliato attraverso l’interruzione prima di risigillarla.
- Richiedono energia (ATP)
Funzione (DNA girasi):
Negli eucarioti - necessaria per separare le MOLECOLE di DNA PRIMA che i CROMOSOMI omologhi si possano separare nel corso della meiosi
Nei batteri - elimina lo stress torsionale generato durante la duplicazione del DNA

Question 27

PROTEINE NECESSARIE PER LA DUPLICAZIONE DEL DNA

Answer 27

1. DNA polimerasi + PRIMASI = per polimerizzazione nucleosidi trifosfati
2. DNA elicasi + proteine SSB = per aprire l’elica del DNA
3. Enzima che digerisce RNA primer (DNA pol I)
4. DNA ligasi = per unire insieme i frammenti di Okazaki
5. DNA topoisomerasi = per togliere il superavvolgimento positivo a monte della forcella di replicazione

Question 28

oriC

Answer 28

• Sequenza che indica l’origine di replicazione (punto specifico sul cromosoma BATTERICO)
• Ad essa si legano numerose PROTEINE per dare INIZIO al processo di replicazione (BIDIREZIONALE poiché procede in entrambe le direzioni a partire dall’origine)
• Ci sono 2 forcelle di replicazione che si muovono in direzioni OPPOSTE

Question 29

PROTEINE CHE INIZIANO LA REPLICAZIONE NEI BATTERI

Answer 29

1. Legame con DNA parentale della proteina iniziatrice all’origine della replicazione (sequenza ricca in A-T)
2. Legame della DNA elica (legata a sua volta all’inibitore dell’elicasi) alla proteina iniziatrice.
3. Caricamento dell’elicasi sul filamento di DNA, accompagnata dal rilascio dell’inibitore dell’elicasi.
4. L’elicasi: apre l’elica + lega la primasi per formare il primosoma.
5. Sintesi dell’RNA primer = rende la DNA polimerasi capace di iniziare la prima catena di DNA.
6. Inizio di altre 3 catene di DNA e formazione delle forcelle di replicazione (che si muovono in direzioni opposte).

Question 30

INIZIO REPLICAZIONE DNA NEGLI EUCARIOTI

Answer 30

Maggior quantità di DNA => Polimerasi più lente (incorporano i nucleotidi a minor velocità)
Per compensare queste differenze => replicano il genoma in piccole porzioni, chiamate REPLICONI (ciascuno possiede la PROPRIA origine di replicazione dalla quale si dipartono, in ENTRAMBE le direzioni, le forcelle di replicazione)
Ciò significa che abbiamo: Molteplici origini di replicazione
≈ 10 - 15% di repliconi è attivo in un certo momento della fase S del ciclo cellulare

Iniziano contemporaneamente la replicazione i repliconi che:

• sono situati vicini in uno stesso cromosoma
• attivi entrambi in un determinato momento di ciclo di sintesi (tendono ad attivarsi sempre allo stesso momento nei cicli successivi)

Fattori che determinano l’inizio della replicazione di una regione cromosomica:
- attività dei geni presenti nella regione
Es. presenza di istoni acetilati, strettamente correlata alla trascrizione genica, è un probabile fattore nella determinazione della replicazione precoce di loci genici attivi
- il suo stato di condensazione
Es. regioni cromosoma più compatte = eterocromatina, sono le ultime regioni ad essere replicate

ARS (Sequenze di Replicazione Autonoma) = sequenze che hanno capacità di PROMUOVERE replicazione del DNA in cui sono contenute (Es. nel lievito ci sono 400 origini di replicazione o ARS)
Elemento centrale di una ARS = sequenza conservata di 11 coppie di basi, funziona come specifico sito di legame per importante COMPLESSO MULTIPROTEICO detto Complesso di Riconoscimento dell’Origine (ORC)
* se ARS subisce mutazione tale che ORC non vi si possa più legare => replicazione NON inizia

Question 31

RESTRIZIONE DELLA REPLICAZIONE

[meccanismo]

Answer 31

Fondamentale che OGNI parte del genoma venga replicata UNA sola volta nel corso di OGNI CICLO cellulare.
Ergo, deve esistere un meccanismo che IMPEDISCA la ripetizione della replicazione di una parte già duplicata.
INIZIO della replicazione in un particolare punto di origine RICHIEDE il PASSAGGIO del punto di ORIGINE stesso attraverso una serie di STADI:
1. ARS lega il complesso multiproteico ORC (rimane legato all’origine di replicazione durante tutto il ciclo cellulare)
Presenza dell’ORC legato = NECESSARIA per iniziare la replicazione

2. Consiste nell’ASSEMBLAGGIO di un complesso DNA - proteina, detto COMPLESSO di PRE-REPLICAZIONE (pre-RC) => “autorizzato” (competente) ad iniziare la replicazione
   Es. gruppo di sei proteine Mcm correlate (Mcm2 - Mcm7) => vengono INSERITE sull’ORIGINE di replicazione ad uno stadio TARDIVO della mitosi o SUBITO DOPO (con aiuto di un fattore accessorio precedentemente legato ad ORC).
   Proteine Mcm si ASSOCIANO a formare un complesso ESAMERICO (6 componenti) a forma di ANELLO (complesso Mcm) => possiede ATTIVITÀ ELICASICA
   * complesso Mcm è l’elicasi replicativa degli eucarioti, responsabile dello svolgimento del DNA alla forcella replicativa (analogo al DnaB)
   Ciascuna origine di replicazione: contiene un DOPPIO complesso esamerico Mcm (cioè 2 elicasi replicative complete) - restano INATTIVE in questa fase del ciclo cellulare (una volta iniziata la replicazione, ciascuna replicasi viaggerà in direzione opposta rispetto all’origine)
3. Assemblaggio di un pre-RC = segna QUEL sito sul genoma come POTENZIALE origine di replicazione; NON garantisce che sarà effettivamente un sito dove verrà avviato il processo.
   Durante la maggior parte dei cicli cellulari: si assemblano un nr maggiore di pre-RC rispetto a quelli che verranno realmente utilizzati -> NON è ancora chiaro cosa determini quale di questi potenziali siti di replicazione sarà successivamente selezionato
   POCO prima inizio fase S del c. cellulare = ATTIVAZIONE di specifiche protein-chinasi che determina la FOSFORILAZIONE del complesso Mcm2-Mcm7 elicasi (e di altre proteine) + INIZIO della replicazione (nel sito selezionato sul genoma)
   Importante protein-chinasi: CHINASI CICLINA-DIPENDENTE (Cdk)
   - attività ELEVATA dalla fase S -> alla mitosi
   - IMPEDISCE formazione di nuovi complessi pre-replicazione
   => di conseguenza, CIASCUNA origine può essere ATTIVATA solo UNA volta per c. cellulare
   - CESSAZIONE attività Cdk (fine della mitosi) = permette ASSEMBLAGGIO di un pre-RC per il successivo c. cellulare
4. Inizio replicazione = inizio fase S
   Proteine Mcm + forcella di replicazione = si muovono insieme: svolgono ruolo fondamentale per la COMPLETA replicazione di un REPLICONE
   * proteine Mcm formano una DNA elicasi replicativa che srotola DNA in direzione opposte
5. Due FILAMENTI del duplex originale sono stati REPLICATI.
   Abbiamo UN ORC presente a livello di entrambe le origini (viene poi rilasciato).
   Destino proteine Mcm dopo replicazione DIPENDE dalla specie studiata:
   - lievito: allontanate dalla cromatina + esportate dal nucleo
   - mammifero: allontanate dal DNA + rimangono nel nucleo
   * malgrado tutto, proteine Mcm NON possono RIASSOCIARSI ad un’origine di replicazione che è GIÀ stata “accesa”

Question 32

ALCUNE PROTEINE NECESSARIE PER LA REPLICAZIONE

[batteri vs. eucarioti]

Answer 32

Proteine batteri = Proteine eucarioti - funzione

DnaA = Proteine ORC - Riconosce origine di replicazione

Girasi = Topoisomerasi I/II - Elimina superavvolgimenti positivi a monte della forcella di replicazione

DnaB = Mcm - DNA elicasi che srotola duplex parentale

SSB = RPA - Mantiene DNA nello stato di singolo filamento

Complesso- γ = RFC - Subunità oloenzima DNA polimerasi; Caricatore della pinza sul DNA

pol III = pol δ/ε - Sintetizza filamento guida + frammenti di Okazaki; Capace di correggere bozze

Pinza β = PCNA - Subunità oloenzima DNA polimerasi; A forma di anello; Lega polimerasi replicativa al DNA

Primasi = Primasi - Sintetizza RNA primer

(nessuno) = pol α - Sintetizza brevi oligonucleotidi di DNA come parte del primer RNA-DNA

DNA ligasi = DNA ligasi - Unisce frammenti di Okazaki in un filamento continuo

pol I = FEN-1 - Rimuove primer RNA (pol I riempie anche con DNA le lacune che si formano)

Question 33

FORCELLA REPLICATIVA EUCARIOTI

Answer 33

N.B. Replicazione SEMPRE uguale, indipendentemente dal tipo di genoma replicato (sia esso virale, procariotico od eucariotico)

Tutti i sistemi di replicazione richiedono:

• elicasi;
• proteine che si legano al DNA a filamento singolo;
• topoisomerasi;
• primasi;
• DNA polimerasi;
• caricatore della pinza + pinza scorrevole;
• DNA ligasi.

Come nei procarioti, DNA sintetizzato in modo SEMIDISCONTINUO.
Tuttavia, frammenti di Okazaki PIÙ piccoli rispetto ai batteri -> lunghezza media di ≈ 150 nucleotidi

Come la DNA polimerasi II (nei batteri) = DNA polimerasi (eucarioti) esiste in forma di DIMERO
=> lascia ipotizzare che filamento guida e f. in ritardo SINTETIZZATI in modo COORDINATO attraverso REPLISOMA

Negli eucarioti sono state identificate 5 DNA polimerasi principali, α, β, γ, δ, e ε

Polimerasi γ e β = NON coinvolte nella replicazione del DNA nucleare
γ = replica DNA mitocondriale
β = attiva nella riparazione del DNA
Altre 3 polimerasi = hanno un ruolo nella replicazione
α = strettamente associata alla primasi; insieme iniziano sintesi di ogni frammento di Okazaki:
1. dopo che primasi sintetizza breve RNA primer
2. polimerasi α aggiunge un certo numero di desossiribonucleotidi (≈ 20)
δ = sintetizza DNA durante replicazione filamento IN RITARDO
ε = sintetizza DNA durante replicazione filamento GUIDA
Entrambe le pol δ + ε NECESSITANO di una “pinza scorrevole” che leghi l’enzima (polimerasi) al DNA (gli consente di muoversi lungo uno stampo)

Negli eucarioti:
pinza scorrevole = PCNA
caricatore pinza = RFC

Dopo aver:
- sintetizzato un primer RNA +
- un breve segmento DNA
polimerasi α sostituita (a livello giunzione stampo-primer) dal complesso PCNA-polimerasi δ = completa la sintesi del frammento di Okazaki
Quando pol δ raggiunge: estremità 5’ del f. di Okazaki (precedentemente sintetizzato)
=> pol continua lungo stampo f. in ritardo SPOSTANDO il primer:
- rimosso dal filamento DNA neosintetizzato da un’endonucleasi (FEN-1)
- interruzione che ne deriva saldata da DNA ligasi
* Le DNA polimerasi eucariotiche NON possiedono attività esonucleasica 5’-3’, quindi i primers di RNA vengono rimossi da 2 ribonucleasi (RNasi):
H1 (degrada innesco fino all’ultimo ribonucleotide) +
FEN-1 (degrada rimanente porzione dell’innesco)
* Pol γ, δ e ε = posseggono un’esonucleasi 3’-5’ = assicurando che replicazione avvenga con grande accuratezza

Si pensa che:
- FEN-1 e DNA ligasi = reclutate alla forcella replicativa mediante interazione con pinza scorrevole PCNA
- PCNA giochi ruolo importante nell’ “orchestrare” eventi che avvengono durante:
replicazione
riparazione
ricombinazione DNA
Per la sua abilità a legarsi a ≠ gr di proteine = definita “pinza molecolare”

ATTENZIONE! Non è il macchinario di replicazione che si muove lungo il DNA stazionario, ma è il DNA che viene spinto attraverso il macchinario di replicazione fermamente ancorato alla matrice nucleare.
Foci di replicazione = numero di punti (variabile da 50 - 250), dove sono localizzate forcelle di replicazione ATTIVE in un CERTO momento (non sono quindi distribuite a caso nel nucleo)

Question 34

PROBLEMA DELLA REPLICAZIONE TERMINALE

Answer 34

I cromosomi, quindi il DNA delle cellule eucariotiche è lineare => quindi abbiamo delle estremità

Quando noi replichiamo DNA utilizziamo come prima cosa dei primer. Dopo la replicazione del cromosoma parentale sia sul filamento 5’-3’ che su quello 3’-5’, quindi in entrambi i casi, all’estremità 5’ manteniamo i primer RNA.
Nel caso:
a) 3’-5’ = filamento continuo, abbiamo il primo primer RNA e poi avremo la polimerizzazione di tutto il frammento
b) 5’-3’ = avremo i frammenti di Okazaki con i primer che vengono rimossi dalle RNasi, ECCETTO l’ultimo frammento poiché non va riconosciuto nessuna DNA polimerasi a monte
Entrambi i filamenti neosintetizzati si trovano nella stessa situazione: dopo la replicazione i confini 5’ all’estremità avranno mantenuto i primer, perché non c’è niente a monte che polimerizza e che riconosce questo come primer
=> verranno eliminati, ma non c’è niente ai confini che potrà riempire questo spazio perché non c’è nessuna polimerasi che a sua volta abbia un -OH a cui legarsi a monte e che può riempire questi nucleotidi mancanti.
Quindi, a ogni replicazione il cromosoma al 5’ di ogni replicazione si accorcia => le estremità 5’ saranno accorciate rispetto al filamento parentale

Questo non è un grosso problema.
Le estremità di tutti i cromosomi contengono, negli eucarioti, la ripetizione di una sequenza.
* leggi TELOMERI

Question 35

TELOMERI E TELOMERASI

Answer 35

TELOMERI = tratti TERMINALI dei cromosomi costituiti dalla RIPETIZIONE di una corta sequenza (nell’uomo TTAGGG ripetuta dalle 500 - 5000 volte)

Essendo sequenze ripetute (come, ad esempio, nel caso dell’eterocromatina) => non contengono geni. Ergo, se vengono accorciate queste sequenze, non è un grosso problema per la cellula, perché:
non ci sono geni che devono essere espressi => cellula può permettersi l’accorciamento delle regioni telomeriche

Normalmente durante l’embriogenesi le cellule si dividono, però le cellule subiscono destino differenziativo => non si dividono più + telomeri risultano accorciati = processo finito.
Ma se la cellula deve continuare a duplicarsi (Es. cellule staminali ematopoietiche) e i cromosomi si accorciano ogni volta, si rischia di:
- arrivare all’interno del cromosoma e
- iniziare ad accorciare regioni che contengono in geni.
* possiamo dire che, in qualche modo, i telomeri proteggono le estremità dei cromosomi

TELOMERASI = complesso ribonucleico proteico che entra in azione in questi casi.
Complesso ribonucleico: 1 parte RNA + 1 parte proteine
* qui la proteina ha ATTIVITÀ CATALITICA perché ha funzione di trascrittasi inversa (vedi sotto)
Funzione: in grado di riallungare i telomeri => risolve il problema dell’accorciamento
Cellule che sono in fase duplicativa attiva (quindi che si duplicano) esprimono al loro interno le telomerasi.

REPLICAZIONE TELOMERO:
Abbiamo detto che i telomeri sono costituiti da questa sequenza: TTAGGG ripetuta varie volte. PROTRUDING = si dice quando il filamento 5’ si accorcia e quindi si crea un’estremità 3’ “libera” (appartiene al filamento parallelo) a cui NON corrisponde un doppio filamento (poiché si interrompe il 5’).
ATTENZIONE! Questa parte è troppo piccola per poter permettere a un primer di essere aggiunto e la polimerasi di sintetizzare, quindi che succede?
Questa estremità 3’ a filamento singolo viene riconosciuta dalla telomerasi (RNA + proteina) = che contiene una sequenza (di Adenine e Citosine) di RNA complementare al telomero -> si lega al filamento singolo solo in parte (l’altra parte rimane non legata):
fornisce alla parte proteica della telomerasi stessa una sequenza di RNA che viene utilizzata come templato per allungare il telomero

Parte PROTEICA ha una caratteristica = è una trascrittasi inversa: proteine (precisamente polimerasi) che utilizzano, invece del DNA, l’RNA come stampo.
Telomerasi usa come stampo l’RNA per allungare il telomero.
Quindi, allunga il filamento al 3’ = diventa lunga abbastanza da poter essere riconosciuto da una:
- primasi, lo lega e fa un altro piccolo primer;
- una polimerasi che riallunga la sequenza telomerica.
A questo punto, si avrà di nuovo la rimozione del primer, quindi si avrà di nuovo un’estremità 3’ protruding, però in generale il telomero risulterà allungato.

Chiaramente le telomerasi sono attive laddove le cellule si dividono, quindi, ad esempio:
- neurone = inattive
- cellula tumorale = attive
Infatti, telomerasi spesso oggetto di terapia genica contro il tumore, poiché:
se i telomeri si accorciano troppo = cellula va a invecchiare, cioè c’è un input di invecchiamento cellulare e la cellula va in apoptosi
Ergo, telomeri = indice di quanto è vecchia una cellula; più sono corti, più cicli di replicazione ha subìto.
* quindi bersagliare telomerasi può indurre la cellula verso la morte: caratteristica delle cellule tumorali = proliferazione incontrollata => per poterlo fare devono avere i telomeri sempre lunghi.
Se io bersaglio le telomerasi = speranza di indurre queste cellule verso l’apoptosi.

RICORDA SEMPRE CHE: cellula tumorale = risultato NON di una mutazione, ma di PIÙ mutazioni contemporanee, spesso queste mutazioni riguardano più meccanismi di controllo della cellula

Question 36

RIPARAZIONE DEL DNA

Answer 36

Ogni cellula di mammifero perde circa 10.000 basi al giorno!
Queste perdite creano LESIONI che se non vengono riparate posso portare ad alterazioni permanenti (o mutazioni del DNA). Per cui esiste un intero sistema di riparazione del DNA: gli permette di mantenere il più possibile le sue funzioni, i suoi geni attivi.

Da considerare che nel corso della vita:
DNA invecchia e non è quello che avevamo originariamente,
mentre DNA cellule germinali, è mantenuto INTATTO proprio perché non viene esposto a tutti i danni in cui invece il DNA delle cellule somatiche viene esposto
Mutazione cellula:
- che si sta differenziando in GAMETE: alterazione genica può TRASMETTERSI alla generazione successiva
- SOMATICA: gli effetti possono INTERFERIRE con trascrizione + replicazione; PROVOCARE trasformazione maligna della cellula; ACCELERARE processo d’invecchiamento di un organismo
Es. Problema della pecora Dolly: è stata creata da una cellula somatica di un organismo adulto e presentava già da giovane artrosi ecc., dunque caratteristiche tipiche di una pecora vecchia. Quindi era invecchiata precocemente.
Motivo: DNA utilizzato per crearla era di una cellula che aveva già subito dei danni.

Danno DNA:
- spontaneo: perdita delle 10.000 basi al giorno
- indotto:
a) raggi UV inducono la formazione di dimeri di Timina: se due T si trovano vicine, invece di creare legami H con le A corrispondenti, creano dei legami covalenti tra di loro
Problema: sequenza del genere non può essere trascritta in maniera corretta e quindi il gene non può essere espresso in maniera corretta
b) alchilazione = aggiunta di gruppi metilici a varie posizioni sulle basi azotate
c) agenti cancerogeni (es. benzopirene) reagiscono con le basi inserendo grossi gruppi chimici alla molecola di DNA

Question 37

RIPARAZIONE PER ESCISSIONE NUCLEOTIDICA (NER)

Answer 37

Tutti gli organismi sono esposti ai raggi ultravioletti => sviluppato meccanismi per ripararsi
Es. FOTORIATTIVAZIONE: assente nel nell’uomo.
Questo meccanismo si chiama di RIPARAZIONE DIRETTA dei dimeri di Timina

Luce stessa => attiva degli enzimi di fotoriattivazione = in grado di rompere legami covalenti di DNA + di creare legami H

Sistema alternativo: riparazione per escissione di nucleotidi (sistema NER)
In questo sistema vengono utilizzate quelle DNA polimerasi deputate alla riparazione del danno del DNA.
Danno riconosciuto perché: legame covalente nelle timine crea una struttura distorta => qualcosa non va nella doppia elica del DNA
Meccanismo:
Elicasi = tagliano regione che si trova a monte e a valle dei dimeri di timina + allontanano frammento DNA
DNA polimerasi = ripolimerizzano sequenza mancante utilizzando il sito -OH esposto
DNA ligasi = rilegano i frammenti

Cellula si accorge che qualcosa non va durante trascrizione:
- TFIIH = fattore di trascrizione (uno dei componenti chiave): proteina coinvolta nella trascrizione mRNA; riconosce i dimeri di timina nell’mRNA => chiama le DNA polimerasi

Questa riparazione può percorrere due vie:

1. Via accoppiata alla trascrizione
2. Via genomica globale (più lenta, meno efficiente)

Question 38

RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DI BASE (BER)

Answer 38

Rimozione nucleotidi alterati => generati da composti chimici reattivi (derivanti dalla dieta / prodotti del metabolismo)

Es. rimuove una base alterata detta 8-ossiguanina (oxo-G) ≠ dalla guanina
Meccanismo BER:
- Inizia mediante DNA glicosilasi -> riconosce alterazione + rimuove base (attraverso rottura legame glicosidico: unisce base alla molecola di zucchero desossiribosio)
- Enzima si muove lungo DNA “ispezionando” ogni coppia G-C nel duplex
- Enzima incontra coppia di basi oxoG-C
- Enzima si inserisce sulla molecola DNA + provoca rotazione nucleotide di 180° fuori dall’elica di DNA e verso l’enzima
A questo punto abbiamo due opzioni:
1. Base ispezionata è una oxo-G: viene alloggiata nel sito attivo dell’enzima + tagliata dallo zucchero a cui è associata
2. Base ispezionata NON è oxo-G, ma normale guanina: NON può adattarsi al sito attivo + ritorna nella sua posizione nell’elica

Purina/pirimidina alterata rimossa => anche zucchero “decapitato” viene rimosso per azione combinata di: un’endonucleasi specializzata (AP) + DNA polimerasi β
AP = taglia scheletro DNA
DNA polimerasi β = attività fosfodiesterasica che rimuove restante zucchero-fosfato + riempie interruzione inserendo nucleotide complementare
DNA ligasi III = ricongiunge filamenti

ATTENZIONE!
Citosina può trasformarsi in Uracile => motivo per cui la selezione naturale ha favorito uso della Timina come base del DNA
Se uracile fosse stato mantenuto => sistemi di riparazione avrebbero avuto difficoltà nel distinguere:
- Uracile che “apparteneva” a un particolare sito, da
- uno formato per alterazione della Citosina

Question 39

RIPARAZIONE ROTTURE A DOPPIO FILAMENTO (DSB)

Answer 39

Generate da:

• forme di radiazioni;
• agenti chimici, compresi quelli usati in chemioterapia.

Singola rottura a doppio filamento => può causare serie anomalie cromosomiche => gravi conseguenze per cellula

Nelle cellule di mammifero, meccanismo di riparazione predominante: NHEJ (Unione delle Estremità Non Omologhe)
Dove, complesso di proteine:
- si lega alle estremità rotte del duplex +
catalizza una serie di reazioni per unire nuovamente estremità rotte del DNA
- Via di riparazione introdotta anche DURANTE replicazione

Altro meccanismo di riparazione: HR (Ricombinazione Omologa)

• Richiede presenza di un cromosoma omologo => serve da stampo per riparazione del filamento rotto
• Via PIÙ accurata: meno errori nella sequenza di basi del DNA riparato (rispetto a NHEJ)
• Via impiegata SOLO DURANTE ciclo cellulare, DOPO riparazione: poiché richiede presenza di cromosoma omologo nel nucleo

Difetti in entrambe le vie di riparazione => associati ad un’aumentata suscettibilità al cancro

Question 40

TRA REPLICAZIONE E RIPARAZIONE

Answer 40

In alcuni casi, lesione DNA = NON riparata finché QUEL segmento non va incontro a REPLICAZIONE

Processo:
- Macchinario di replicazione ARRIVA al punto (sul filamento stampo) dove è PRESENTE il danno => lo BLOCCA
- Vengono emessi SEGNALI => determinano RECLUTAMENTO di una PARTICOLARE polimerasi
- polimerasi replicativa (pol δ o ε) temporaneamente sostituita dalla: pol η = in grado di riparare il danno
Funzione membri della stessa superfamiglia di pol η: prendere parte alla Sintesi per Scavalcamento della Lesione (TLS)

Le TLS polimerasi:

• In grado di INCORPORARE solo POCHI nucleotidi (mancano di processività)
• NON in grado di operare la correzione di bozze
• NON hanno nei siti attivi caratteristiche geometriche stringenti => più propense ad incorporare nucleotide errato (non complementare)

Question 41

GENE

Answer 41

• Unità EREDITARIA fondamentale degli organismi viventi
• PORZIONI di genoma localizzate in PRECISE posizioni all’INTERNO della sequenza di DNA (o RNA in certi virus) + contengono INFORMAZIONI necessarie per CODIFICARE molecole che hanno una funzione
• Sono organizzati nei CROMOSOMI
• Procarioti: costituito quasi esclusivamente da sequenze codificanti
• Eucarioti: anche non codificanti.
Esoni = codificanti; introni = non codificanti

Andando avanti nella scala evolutiva:
- Aumento delle coppie di basi
- Aumento del nr geni
- Diminuzione densità genica (cioè il nr di geni per megabase = 1 mln di basi)
=> i geni sono più DISPERSI, perché tra loro ci sono:
1. regioni intergeniche non codificanti;
2. introni;
3. sequenze ripetitive, che si trovano: tra geni OPPURE all’interno degli introni (LINE - Long; SINE - Short)

Question 42

CROMOSOMA

Answer 42

• Struttura con cui:
- ciascuna unità funzionale di DNA DOPO essersi DUPLICATA,
- si COMPATTA associata a SPECIFICHE proteine e
- viene TRASMESSA alle cellule figlie.
• Filamento di DNA NON distinguibile nella cromatina, RESPONSABILE della TRASCRIZIONE genica durante la fase funzionale della cellula

Question 43

FUNZIONI DNA

Answer 43

• DEPOSITARIO dell’INFORMAZIONE che codifica caratteri ereditari: nel DNA IMMAGAZZINATE le istruzioni che DETERMINANO tutte le caratteristiche ereditabili che un organismo può MANIFESTARE
• contiene le INFORMAZIONI per DIRIGERE la propria REPLICAZIONE: replicazione DNA permette la TRASMISSIONE delle info genetiche da una cellula madre alle cellule figlie o da un individuo alla progenie
• contiene informazioni per dirigere il processo di SINTESI delle PROTEINE: i SINGOLI geni portano info per SPECIFICHE proteine, quindi deve esserci un meccanismo per utilizzare le informazioni immagazzinate in un gene per dirigere la sintesi di uno specifico polipeptide

Question 44

DNA SEMICONSERVATIVO

Answer 44

Si dice di essere semiconservativo perché entrambi i filamenti di DNA diventano stampo per la sintesi di un nuovo filamento.

Dunque, ciascuna delle nuove molecole di DNA è costituita da:
• 1 filamento originale (parentale) della cellula madre
• 1 neofilamento (che è stato neosintetizzato)