Chromatographie Flashcards
l’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de 2 facteurs.
Quels sont-ils?
pH de la solution
Concentration d’ions en solutions
Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de 2 caractéristiques
Lesquelles sont-elles
La nature de leur matrice
Le type de groupement fonctionnel utilisé pour lié les protéines.
Quelles sont les 3 propriétés communément utilisées pour effectuer un fractionnement cellulaire?
Interactions ioniques
Taille
Spécificité
Lier toutes ces types de technique chromatographique selon la propriété correspondante.
1.Chromatographie par gel-filtration
2.Chromatographie d’affinité
3.Chromatographie par échange d’ions
A. Taille
B. Charge ionique
C. Spécificité
1.A
2.C
3.B
Nommer et expliquer en quoi consiste la phase stationnaire et la phase mobile.
Phase stationnaire = Substance ou le mélange est séparé
Phase mobile = Mélange qui doit être séparé
Placé ses cations en ordre qui favorisent le moins la précipitations à ceux qui favorisent le plus la précipitations.
Mg 2+, N(CH3)4+, K+
N(CH3)4+ > K+ > Mg2+
De quoi sont fait les matrices utilisées en chromatographie
Polymères insolubles sous forme de billes (Cellulose, Polyacrylamide, agarose) ils sont appelés résines
Vrai ou faux
Chromatographie par échange d’ions utilise la charge net d’une protéine à son point isoélectrique.
Faux, la protéine possède une charge en dessous ou au dessus de son point isoélectrique
Quelle type d’interaction est exploité lors d’un chromatographie par échange d’ions
Attraction élèctrostatique
Quelles sont les 2 classes d’échangeurs et quelles charges (postive ou négative) portent-ils?
Échangeur anionique avec Charge +
Échangeur Cationique avec Charge -
Vrai ou faux?
Un échangeur FORT reste pleinement chargé dans une gamme (Range) de pH beucoup plus important alors qu’un échangeur FAIBLE reste pleinement chargé dans un gamme de pH plus restreint.
Vrai
Nommer 4 types de groupements chimique utilisés dans les matrices de chromatographie
Dites s’ils sont anionique ou cationique et faible ou fort
QAE (Amine quaternaire) = Anionique Fort
sulfonate= Cationique fort
DEAE (amine tertiaire)= Anionique faible
CM (Carboxyméthyle)= cationique faible
Nommer les 3 principes d’opérations de la chromatographie
1) Liaison à la colonne
2) Lavage
3) Élution
Expliquer la relation négative des contre-ions sur les protéines lors d’une chromatographie d’échange d’ions
Les protéines lors d’une chromoatographie sont déstabilisés par des contre-ions qui peuvent se liés à la portéine ou la matrice.
Il faut modifier le pH et les concentrations pour faire en sorte que les protéines ont plus d’affinité pour l’échangeur que les contre-ions
Vrai ou Faux?
Plus l’affinité de liaison d’une
protéine pour l’échangeur est forte,
plus la migration sera retardée
Vrai
En quoi consiste le lavage
Laver le mélange de protéine avec solution tampon. Les protéines avec moins d’affinité se déplaceront plus rapidement alors que ceux qui on plus d’affinité seront retardés dans la colonne.
En quoi consiste l’élution
Nettoyer la colonne avec un tampon de concentration saline supérieur au tampon de lavage en utilisant des gradients de sels. Les ions de sels en excès se lieront aux charges de la matrice et bloqueront l’attachement de la protéine
Quelles sont les 2 types d’élution utilisés pour la chromatographie
Fractionnée et par gradients
Expliquer les types d’élutions fractionnée et par gradients
Fractionnée = ajout de tampon avec concentration de sels plus élèvés que le tampon de lavage
Gradient = Ajout de tampon avec concentration saline qui varie de façon linéaire en fonction du volume traversant la colonne.
Quells sels sont utilisés majoritairement pour faire des gradients
KCl et NaCl
Expliqué dans vos mots le principe de chromatographie par gel filtration ou tamis moléculaire (comment sont séparés les protéines)
Le tamis moléculaire est un agencement de petites billes qui possède des pores qui laisse rentré quelques petites molécules jusqu’a un certains poids (limite d’exclusion). Ces molécules traversent la colonne plus lentement. Les molécules de plus grande taille traverseront plus rapidement dans le front du tampon par les petits espaces formés par les billes.
La chromatographie par gel filtration sépare les molécules selon 2 choses. Nommer les
Taille et forme
De quoi est consititué le phase stationnaire pour la chromatographie par gel-filtration
Réseau de polymères réticulé possédant des pores laissant passé certaines molécules plus petites
Qu’est ce que la limite d’exclusion
La taille maximal dans lequel les protéines peuvent passés à travers les pores
La porosité d’un gel dépend de 2 choses. Quelles sont -elles
1) Mass moléculaire du polymère
2) Nombre de liaisons croisées entre les molécules du polymère
De quoi peut être formé les billes de gel pour la chromatographie par gel-filtration (3)
Dextrane
Agarose
Polyacrylamide
Si plusieurs molécules de différentes tailles penetrent dans les billes de gels. Quelles molécules (plus grande ou plus petite) seront éluées des billes de gels en premier
Les plus grosses molécules ayant pénétrés dans les billes seront éluées en premier avant les plus petites
Que peut-on déterminé avec le volume d’élution relatif Ve/Vo
La masse moléculaire d’une protéine (estimation)
Quelle type de membrane est utilisé pour la dyalise
Membrane semi-perméable
En quoi consite la dyalise
Consite à plonger une solution de protéines contenues dans un sac avec membrane semi-perméable dans une solution tampon pour que les sels diffusent vers l’extérieur
Quelles types de molécules diffuse à travers une membrane semi-perméable lors d’une dyalise
Des sels
En quoi consite la chromatographie d’affinité
Utilisation d’un ligand sur la matrice pour lié un protéine spécifique et la séparée d’un mélange de protéine
Vrai ou Faux?
Pour que la chromatographie d’affinité marche, il faut que le ligand soit attaché d’une manière covalente à la matrice
Vrai
Nommer 2 facons pour détacher la protéine fixé à son ligand
Ajout d’excès de ligand
Changer pH, force ionique ou température
Laquelle parmi la chromatographie par échange d’ions, par gel- filtration ou par affinité nous donne une protéine plus pure
Expliquer
Chromatographie d’affinité
Utilisation des caractéristiques biochimiques uniques d’une protéine et non de caractéristiques physico-chimiques partagées par d’autres
De quoi dépend la quantité de protéine lié au ligand? (3)
-du Kd’ (l’interaction est trop faible si la valeur >10-4 M)
-de la concentration de protéine dans l’extrait
- du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M)
Qu’est ce que la constante de dissociation (Kd)
Mesure d’affinité d’une protéine pour son ligand
Quelles sont les 3 caractéristiques de la matrice pour utilisée pour la chromatographie d’affinité
- chimiquement inerte
- avoir une grande porosité
- présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands
Que utilise t’on pour êmpcher l’ecombrement stérique de réduire la liaison protéine et ligand
Utilisé un bras espaceur
la liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose se fait
en deux temps:
1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
Quelles sont les 5 méthodes qui permette de détecter les protéines quantitativement et spécifiquement dans les différentes fractions de l’éluat
-absorption des protéines dans l’UV
-essai colorimétrique
-essai enzymatique
-détection de la protéine sur gel SDS-PAGE
-détection de la protéine avec un anticorps
Quelles sont les 2 étapes pour lié le ligand de facon covalente à la matrice.
1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
