Chapitre 6 - Isolement et culture des bactériophages et des amibes Flashcards
Les bactériophages sont des _____ _____ omniprésents sur la planète ayant une population de _____, ce qui en fait l’entité biologique la _____ _____ sur la terre
virus bactériens, 10^31, plus abondante
Pourquoi dit-on entité biologique et non microorganisme?
Puisque la majorité des scientifiques s’accordent pour affirmer que les virus ne sont pas des organismes vivants.
Nommer quelques raisons publiées dans la revue Nature pour exclure les virus des êtres vivants.
- Ne possèdent qu’1/2 des types d’acides nucléiques
- Ne possèdent pas la machinerie enzymatique pour permettre de générer de l’énergie
- Incapables de se diviser seuls
- Évolution impossible sans les cellules hôtes (parasites obligatoires)
- Polyphylétiques (plusieurs origines évolutionnaires)
Quelles sont les deux grandes approches dans l’isolement des bactériophages?
- Approche physique
2. Approche biologique
L’approche physique est:
Une approche sans enrichissement qui utilise la filtration tangentielle pour obtenir une suspension concentrée de virus à partir d’un échantillon environnemental.
L’approche biologique est:
Une approche mettant à profit la possibilité d’enrichir une population de phages en présence de leur bactérie hôte.
Quelles sont les trois grandes étapes de l’approche biologique?
- Collecte des échantillons
- Enrichissement physique
- Enrichissement biologique et mise en évidence
La méthode standard d’échantillonnage exige quel poids d’échantillon solide?
Quelques grammes
Pour un échantillon liquide, quel volume est à prélevé?
1L (1000ml)
Pourquoi doit-on être prudent lors du prélèvement des échantillons?
Pour ne pas contaminer l’extérieur des contenants (possibilité de bactéries pathogènes).
Suite à l’échantillonnage (solide), quelles sont les étapes?
- Mise en suspension dans un tampon liquide (1h min.)
- Centrifugation (10 000g)
- Filtration du surnageant (0,2 microns)
Quelle est la différence principale pour un échantillon liquide?
Ne doit pas être remise en suspension, elle est déjà en suspension.
Suite à l’enrichissement physique, _____ des phages peut être effectuée si le phage est en _____ assez importante.
L’énumération, concentration
Pourquoi doit-on “nettoyer” les échantillons?
Parce que sinon la croissance va masquer les plages de lyse.
Comment est enrichie biologiquement l’enrichissement physique?
Elle est mélangée avec la bactérie hôte dans un milieu permettant sa croissance additionnée de CaCl2.
Que fait le CaCl2 dans le milieu d’enrichissement?
C’est un composé qui favorise la fixation du phage sur sa cellule cible.
En quoi consiste la méthode de mise en évidence du phage?
- Ensemencer la souche hôte à confluence sur gélose additionnée de CaCl2 et laisser sécher
- Déposer 5ul du surnageant
- Incuber pendant 18-24
- Observer la présence de plages de lyse
Vrai ou faux: la méthode de mise en évidence ne permet que de vérifier 1 surnageant à la fois.
Faux - on peut utiliser cette méthode pour vérifier plusieurs surnageants sur une même gélose.
L’enrichissement biologique de phages dans leur environnement naturel est appelé: _____.
Enrichissement biologique in situ
Expliquer le principe d’enrichissement biologique in situ.
- Cultiver en grande quantité la bactérie d’intérêt en labo
- Verser cette culture à l’endroit d’étude (sol, composte)
- Échantillonner le sol quelques jours après inoculation
- Approches d’enrichissement en labo
Après enrichissement, comment fait-on pour assurer qu’il n’y a qu’un seul phage isolé?
Purification du phage
Quelles sont les deux approches de purification des phages?
- Approche par striation
2. Approche par dilution
Décrire brièvement l’approche par striation.
Striation des phages sur un Pétri sur lequel est étalé la souche hôte, observation de plages de lyse.
Décrire brièvement l’approche par dilution.
Suspension de phages est diluée de façon décimale, dilutions plus élevée choisies, volume prélevé et mélangé avec la bactérie hôte dans une gélose molle, étalée à la surface d’une gélose, incubation, observation de plage de lyse, procédure répétée 2X à partir d’une plage de lyse isolée.
La préparation d’un _____ est la première étape nécessaire à la caractérisation d’un phage.
Lysat de phages
La concentration de phages dans un lysat peut être déterminé par _____ _____ ou par _____ _____.
Méthodes classiques (titre de phages infectieux), méthode moléculaire (copies de génome).
