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Salma- biologie moléculaire > Chapitre 3 : Manipulation de l'ADN > Flashcards

Chapitre 3 : Manipulation de l'ADN Flashcards

1
Q

Comment peuvent se décrire les techniques et protocoles utilisés pour accomplir la transgénèse?

A

spécifiques aux espèces que l’on veut modifier génétiquement.

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Q

Quelles sont les étapes générales de la transgénèse?

A
  1. Sélection du gène étranger (ou
    gène d’intérêt)
  2. clonage dans le
    plasmide adéquat
  3. Transformation bactérienne pour
    distribuer le plasmide avec le gène
    d’intérêt à la cellule végétale.
    4.
    Incorporation
    de l’ADN
    étranger dans
    le génome de
    la plante
  4. Sélection des cellules transformées et
    croissance de plantules.
  5. Les plantes obtenues seront totalement
    transgéniques : toutes leurs cellules possèderont le
    gène d’intérêt (ADN étranger)
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3
Q

À quoi sert la PCR?

A

utilisée pour produire une
grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise à l’aide d’une ADN
polymérase.

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4
Q

Par quoi est délimitée la séquence de la PCR?

A

Cette séquence est délimitée par les amorces utilisées.

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5
Q

Quelle est la première étape de la réaction PCR?

A

Dénaturation de l’ADN bicatenaire (>90degrés)
Permet d’accéder à l’ADN matrice sous forme monocatenaire

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6
Q

Quelles sont les amorces nécessaires au PCR?

A

une amorce sens (forward) et une
amorce anti-sens (reverse). Chacune de ces amorces sera complémentaire
à un des brins de l’ADN initial à amplifier et devra être sélectionnée
attentivement pour assurer une réaction optimale.

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7
Q

Comment est utilisée l’ADN polymérase?

A

• L’ADN polymérase utilisée pour permettre la polymérisation des
nouveaux brins à partir des nucléotides libres est résistante à de hautes
températures

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8
Q

Quelle est la meilleure température pour l’ADN polymérase de la PCR?

A

son optimum d’action se situe au-delà de la température
d’hybridation et en dessous de celle de la dénaturation

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9
Q

Par quoi sont contrôlés les changements de température lors de la PCR?

A

les changements de
température sont contrôlés par un thermocycleur selon nos spécifications

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10
Q

Combien de cycles de dénaturation-hybridation-polymérisation sont nécessaire?

A

Plusieurs
cycles de dénaturation-hybridation-polymérisation sont effectués pour
permettre la production d’une grande quantité de copies.

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11
Q

Quelles sont les composantes nécessaires à la réaction?

A
  • ‘ADN matrice en quantité et qualité suffisante,
  • les amorces, normalement en forte concentration par rapport à
    celle de l’ADN à amplifier
    -‘enzyme (ADN polymérase),
    -le tampon spécifique de cette enzyme pour en assurer le
    fonctionnement (MgCl2)
    -les 4 désoxyribonucléotides triphosphates : dATP, dCTP, dGTP,
    dTTP.
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12
Q

Quelles sont les 3 périodes différentes du cycle de PCR?

A

: (1) Dénaturation, (2) Hybridation, (3) Élongation.

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13
Q

Qu’est-ce que la dénaturation?

A

Augmentation de la température
pour assurer la dénaturation de tous les brins d’ADN matrice.
L’ADN devient monocaténaire

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14
Q

Qu’est-ce que l’hybridation?

A

Diminution de la température pour
permettre l’hybridation des amorces. Ces oligonucléotides
vont marquer les extrémités de la séquence à amplifier.
Chaque amorce est complémentaire à une partie de la
séquence matrice

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15
Q

Qu’est-ce que l’élongation?

A

Les amorces fournissent les extrémités 3’-OH
nécessaire à l’activité de la polymérase. La température est ajustée à la
température optimale pour l’enzyme et cette dernière polymérise alors le
brin complémentaire à l’ADN matrice jusqu’à son extrémité.

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16
Q

Qu’est-ce que la réaction en chaîne?

A

Les brins d’ADN nouvellement formé
deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation
exponentielle du nombre d’amplicons. On obtient des amplicon qui ont
l’exacte longueur du segment spécifié par le couple d’amorces dès la fin
du 3e cycle.

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17
Q

Qu’est-ce qu’un amplicon?

A

molécule finale
délimitée par les amorces et qui représentera la très grande majorité de
l’ADN final.

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18
Q

Comment s’étend le nombre de produit de la PCR?

A

Le nombre de produits dépend du nombre de cycles (n), du nombre de
molécules initiales d’ADN servant de matrice et de la quantité de réactif
(dNTP, amorces, enzymes…).

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19
Q

Dans les conditions idéales, à quoi correspond le nombre d’amplicon?

A

= (2n- 2n).

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20
Q

Quelles sont les applications de la PCR?

A

Isoler et amplifier une séquence spécifique
1.Identification de polymorphismes (allèles)
2. Diagnostic d’infections
3. Diagnostics prénataux
4.Analyse de l’expression de gène –> RT-PCR (qualitatif) et qPCR (quantitatif)
5. Mutagenèse
6. Fabrication de sonde

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21
Q

Quel est l’intérêt de couper l’ADN en fragment de taille accessible?

A

Si l’on veut étudier un gène particulier ou un segment défini d’un ADN
chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord être coupée en
fragments d’une taille accessible.

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22
Q

Quelles sont les enzymes de restrictions?

A

endonucléases capables de reconnaître
une séquence spécifique d’ADN (site de restriction) et de cliver l’ADN
double brin à cet endroit.

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23
Q

D’où proviennent les endonucléase?

A

Elles proviennent naturellement des bactéries qui les utilisent pour éliminer
(restreindre) tout ADN étranger. Leur propre ADN est protégé par la
méthylation sur les sites de restriction

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24
Q

Quels sont les 4 caractéristiques des sites de restriction?

A
  1. Composés de 4 à 8 nucléotides.
  2. La plupart sont des palindromes (leur séquence est identique sur les 2 brins
    lorsque lue de 5’ vers 3’).
  3. Les sites de restriction étant très courts, ils ont de fortes chances d’être
    présents plusieurs fois dans un génome.
  4. La probabilité qu’une suite particulière survienne dans le génome est égale
    à : 4 nucléotides = 1 pour 44
    (1/256), 6 nucléotides = 1 pour 46
    (1/4096), 8
    nucléotides = 1 pour 48
    (1/65536)…
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25
Q

Quel site de restriction laissera des fragment plus long?

A

Les sites de restrictions de 6 ou 8 paires de bases

26
Q

Quelles sont les types de coupures?

A

franche ou cohésive

27
Q

Qu’est-ce qu’une coupure franche?

A

Les coupures franches produisent des extrémités doubles brins.

28
Q

Qu’est-ce qu’une coupure cohésive?

A

Les coupures cohésives produisent des extrémités libres qui sont
simples brins.

29
Q

Comment se fait la ligation des coupures?

A

Les ligases permettent de lier ensemble les extrémités
libres produites par l’action des enzymes de restrictions en
reproduisant les liaisons phosphoesters.

30
Q

En quoi consiste la ligation?

A

La ligation consiste à relier des molécules d’ADN à l’aide d’une enzyme
ADN ligase qui forme des liaisons phosphodiesters entre les nucléotides. La ligation reforme une molécule d’ADN bicaténaire

31
Q

Comment les ligases peuvent-elles être utilisées?

A

catalyser l’insertion de fragments de restriction compatibles à l’intérieur d’un
vecteur

32
Q

Que produisent les coupures cohésives et en quoi est-ce utile?

A
  • Produit extrémité libre compatible
  • augmente efficacité de la ligation de 100X
  • Assure clonage directionnel
33
Q

Peut-on utilisé deux enymes de restrictions différentes pour lier deux molécules d’ADN ensemble?

A

Oui, tant que les extrémités sont compatibles et les règles d’appariement

34
Q

Est-ce qu’une coupure fait avec 2 enzymes différentes reproduit le site de restriction?

A

NOn

35
Q

Comment agit l’agarose?

A

Agit de manière d’un tamis moléculaire (polysaccharide sous forme d’hélice)

36
Q

Que permet l’électrophorèse sur gel d’agarose?

A

Séparer fragment linéaire d’ADN selon leur taille.

37
Q

Les fragments migrent vers quel pôle du gel, lorsque soumis au champ électrique?

A

Les fragments migrent vers le pôle positif, car l’ADN est chargé
négativement (caractère acide)

38
Q

Que signifie une longue distance de migration pour la longueur du fragment?

A

Une petite taille de fragment.

39
Q

Qu’utilise-t-on pour visualiser l’ADN sur gel?

A

bromure
d’éthidium, capable de s’intercaler entre les bases de la double hélice. Exposé à l’UV.

40
Q

Est-ce que les enzymes sont sensibles à la méthylation de l’ADN?

A

Les enzymes sont sensibles à la méthylation de l’ADN.
Empêche l’action de l’endonucléase…

41
Q

Comment sera le fragment d’ADN avec une séquence précise coupé par une certaine enzyme si selon est répété?

A

Même fragment de restriction au même endroit

42
Q

Pourquoi utilise-ton la cartographie de restriction?

A

On utilise la cartographie de restriction pour comparer la position prévue et
réelle de sites de restriction sur un ADN connu : par exemple un plasmide
bactérien qui sera utilisé comme vecteur

43
Q

Qu’est-il important de faire en cartographie de restriction?

A

le lien entre le nombre de sites de restrictions et le nombre de fragments produits

44
Q

Que doivent-posséder les plasmides bactérien?

A

une ORIGINE DE RÉPLICATION
• un MARQUEUR DE SÉLECTION, habituellement un gène de résistance à
un antibiotique.
• un SITE DE MULTICLONAGE (MCS) permettant l’insertion de
fragments de restriction.

45
Q

Quels sont les trois résultats possibles lors de la liaisons des fragments de plasmides à l’ADN à recombiner avec la liagase?

A
  • Ligase joint le plasmide au gène d’intérêt : ADN recombinant
  • Plasmides vont se refermer sur eux-mêmes
  • Fragments d’ADN recombinant (gène d’intérêt)vont aussi se refermer sur eux-mêmes
46
Q

Quelles sont les seules bactéries qui seront sélectionnées?

A

Bactéries qui ont incorporés le plasmide lors de la transformation

47
Q

Que permet le vecteur de propagation?

A

Permet de répliquer le vecteur en grande quantité dans la bactérie

48
Q

Que signifie avoir un vecteur de propagation?

A
  • Amplifier ADN particulier
  • ADN recombinant et gène d’intérêt ne sera pas transcrit ou exprimé dans la bact. (pas de promoteur)
  • Ori haut rendement
49
Q

Que permet le vecteur d’expression?

A

Possèdent un promoteur actif et permettent la
transcription de l’ADN recombinant

50
Q

Que permet le promoteur dans le vecteur d’expression?

A

Promoteur répond à la régulation génique et généralement dérivée du
génome de l’organisme hôte.

51
Q

De quoi dépend le nombre de copies du vecteur produit?

A

De la facilité de l’ouverture de l’ORI.

52
Q

Comment savoir si notre bactérie à incorporé le vecteur?

A

Possède un marqueur de sélection –> résistance à antibiotique et lorsqu’on fait pousser sur milieu sélectif, seule bact ayant incorporé peuvent survivre

53
Q

Que signifie la couleur bleu dans la sélection bleue/blanche? La blanche

A

Bleue = sans vecteur
blanche = avec vecteur

54
Q

Qu’est-ce que la transformation?

A

Transformation : introduction d’un ADN étranger libre dans le milieu
dans une cellule procaryote. ADN linéaire ou plasmide.

55
Q

Qu’est-ce que la transfection?

A

Transfection : introduction d’un ADN étranger dans une cellule eucaryote.

56
Q

Qu’est-ce que la transduction?

A

Transduction : transfert d’ADN entre bactéries par l’entremise de phages
(virus)

57
Q

Qu’est-ce que la transfection transitoire?

A

ADN incorporé reste indépendant du génome et sera éventuellement perdu pas transmis

58
Q

Qu’est-ce que la transfection stable?

A

Intégrer au génome : incorporer ectopique (au hasard) ou remplacer un gène

59
Q

Que peut-on faire chez la plante comme transfection?

A

Transfection des gamètes ou formation de cals

60
Q

Qu’est-ce que la méthode sanger? (5 étapes)

A
  1. Besoin de séquencer un seul brin: dénaturation de l’ADN. Le brin gardé
    devient le brin matrice.
  2. Choix d’une amorce connue (comme pour la PCR). Peut être spécifique
    à notre séquence ou spécifique à la séquence de notre vecteur.
  3. À partir de la jonction amorce-matrice, l’ADN polymérase réplique
    l’ADN. On doit fournir des dNTPs normaux.
  4. On ajoute un des didésoxyribonucléotide (ddNTPs). La réplication est
    arrêtée avec l’incorporation d’un ddNTP (spécifique).
  5. On recommence les étapes 3 et 4 plusieurs fois, toujours à partir de la
    même amorce et en arrêtant la réaction avec différents ddNTPs.
61
Q

Qu’est-ce qui stop la réplication avec la méthode sanger?

A

ddnTP car pas d’appariement

62
Q

Qu’est-ce qui permet la lecture automatique des séquençage lu par séquenceur?

A

La séparation des fragments d’ADN par chromatographie sur colonne.

Salma- biologie moléculaire (13 decks)

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