Chapitre 3 Flashcards
comment sont toujours commandées nos amorces (sens)
5’ vers 3’
comment faire pour trouver l’amorce anti-sens dans une séquence
reverse-complement
qu’est-ce que le nombre de cycles de PCR change au niveau du résultat obtenu
+ de cycle = + d’amplicon. Il n’y a pas de problème tant qu’on reste dans l’intervalle de 20-40 cycles pour ne pas être restreint dans nos réactifs
qu’est-ce qui détermine le choix de la température à l’étape d’élongation
l’enzyme, peu importe l’ADN
quel est le lien entre Tm et la température d’hybridation
si on chauffe trop, l’hybridation n’est pas stable, si ce n’est pas assez, ce n’est pas spécifique. Faut trouver une température d’hybridation idéale
introduction d’un gène étranger dans un génome
transgénèse
utilisée pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise à l’aide d’une ADN polymérase
la PCR
par quoi est délimité la séquence d’ADN utilisée dans la PCR
les amorces utilisées
utilisée pour permettre la polymérisation des nouveaux brins à partir des nucléotides libres - résistante à des hautes températures
ADN polymérase
le maximum d’action de l’ADN polymérase se situe entre quelles températures
au delà de la température d’hybridation et en dessous de celle de la dénaturation
température optimum pour la Taq polymérase
72 degrés celcius
pour permettre la polymérisation en chaîne par quoi sont contrôlés les changements de température
thermocycleur
formule pour trouver Tm
2(A+T) + 4(C+G)
5 composantes de la PCR
ADN matrice
amorces (en fortes concentrations par rapport à celle de l’ADN à amplifier)
enzyme (ADN pol.)
tampon (spécifique de l’enzyme)
4 dNTP
quelles sont les trois étapes de chaque cycle de PCR
dénaturation, hybridation, élongation
définis l’étape de dénaturation de la PCR
augmentation de la température pour assurer la dénaturation de tous les brins d’ADN matrice ainsi que les amorces. l’ADN devient monocatenaire
définis l’étape d’hybridation de la PCR
diminution de la température pour permettre l’hybridation des amorces. Ces oligonucléotides vont marquer les extrémités de la séquences à amplifier (chaque amorce est complémentaire à une partie de la séquence matrice)
définis l’étape d’élongation de la PCR
les amorces fournissent les extrémités 3’OH nécessaires à l’activité de la polymérase. La température est ajustée à la température optimale pour l’enzyme et cette dernière polymérise alors le brin complémentaire à l’ADN matrice jusqu’à son extrémité ou jusqu’à ce qu’elle se détache de l’ADN matrice
définis l’étape de réaction en chaîne de la PCR
Les brins d’ADN nouvellement formés deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation exponentielle du nombre d’amplicons
formule pour le nombre d’amplicons (PCR)
2^n - 2n
qualitatif. permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Suite à la rétrotranscription de l’ARN en ADN, les mêmes étapes de la PCR sont effectuées. La visualisation du résultat permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle
RT-PCR
quantitatif. utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière bcp plus précise
qPCR
pour l’analyse de l’expression des gènes, que faut-il faire aux ARNm d’un organisme
ils sont d’abord isolés et ensuite rétrotranscrits en ADN à l’aide d’une rétrotranscriptase (RT)
applications de la PCR - identification de polymorphismes
il y existe plusieurs variantes d’un même gène dans la population
amplification et séquençage de la séquence d’intérêt afin d’identifier quel allèle particulier porte un individu donné (scènes de crime, test de paternité)
applications de la PCR - diagnostic d’infections
l’ADN trouvé dans un échantillon provenant d’un malade est amplifiée avec des amorces spécifiques pour les gènes viraux ou bactériens - amplification permet de détecter la présence du parasite - on peut trouver c’est quel parasite en séquençant l’ADN amplifié
applications de la PCR - diagnostics prénataux
échantillons d’ADN du foetus est prélevé, les séquences clés sont amplifiées et analysées - détection de maladies héréditaires ou des anomalies chromosomiques
si on veut étudier un gène particulier ou un segment défini d’ADN chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord…
être coupée en fragments de taille accessible (100 pb et 20 000 pb)
que sont des enzymes de restriction
des endonucléases capables de reconnaitre une séquence spécifique d’ADN et de cliver/couper l’ADN double brin à cet endroit
d’où proviennent les enzymes de restriction
des bactéries qui les utilisent pour éliminer tout ADN étranger. Leur propre ADN est protégé par méthylation sur les sites de restriction
les sites de restriction sont composés de combien de nucléotides
4-8
concernant les sites de restriction : leur séquence est identique sur les 2 brins lorsque lue de 5’ vers 3’, ils sont des
palindromes
quelles sont les chances des sites de restriction d’être présents plusieurs fois dans le génome
fortes chances, car sont très courts
types de coupures des enzymes de restriction
la coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types : franche ou cohésive
quelle coupure d’enzyme de restriction produit des extrémités libres qui sont simples brins
coupure cohésives
qu’est-ce qui permet de lier ensemble les extrémités libres produites par l’action des enzymes de restriction en formant des liaisons phosphoesters
ligases (permet donc de lier deux fragments d’ADN)
lorsqu’on veut visualiser l’ADN sur un gel d’agarose, les fragments migrent vers quel pôle?
positif, car l’ADN est chargé négativement (caractère acide)
l’agarose est un polysaccharie formant un long polymère sous forme d’hélice. Lorsque solidifiées, ces fibres forment un maillage 3d. Agit à la manière d’un __________________ au travers duquel les molécules d’ADN en mouvement doivent passer
tamis moléculaire
la distance parcourue par la molécule d’ADN sur gel d’agarose est directement ou inversement proportionnelle à sa longueur
inversement
quel composé est utilisé pour visualiser l’ADN sur gel
bromure d’éthidium - capable de s’intercaler entre les bases de la double hélice - devient fluorescent lorsqu’il est exposé à des UV
quel composé permet de facilement déterminer, après digestion avec des enzymes de restriction de déterminer facilement le nombre de sites de restriction présents, car les bandes sont bien définies sur le gel d’agarose
plasmides (plus petits que l’ADNg) - cartographie de restriction
les enzymes sont sensibles à la méthylation de l’ADN, quelle réaction chimique empêche l’action des endonucléases
méthylation
dans le cas de la biologie moléculaire, qu’est-ce qu’un vecteur
molécule d’ADN circulaire susceptible de recevoir un fragment d’ADN étranger pour ensuite le maintenir dans la cellule hôte ; souvent basé sur les plasmides bactériens ou viraux
pour pouvoir être utilisés comme vecteurs de clônage, les plasmides bactériens doivent posséder 3 choses, lesquelles
origine de réplication, marqueur de sélection (habituellement un gène de résistance à un antibiotique), site de multiclonage (MCS : permettant l’insertion de fragments de restriction)
les enzymes de restriction produisent des fragments d’ADN, la ligase joint les fragments d’ADN. Trois résultats sont possibles, lesquels
- lorsque la ligase joint le plasmide au fragment correspondant au gène d’intérêt = plasmide recombiné
- une large portion des plasmides se refermeront sur eux-mêmes (plasmides non recombinés)
- portion des fragments d’ADN du gène d’intérêt se refermeront aussi sur eux-mêmes (ADN non recombiné)
comment est-ce que les coupures cohésives assurent un clonage directionnel
l’incorporation du fragment doit suivre les règles d’appariement des nuléotides et est possible dans une direction seulement
pour deux molécules d’ADN différentes qu’on veut lier ensemble ex fragment de restriction et un vecteur, qu’est-ce qu’on peut faire
- utiliser la même enzyme de restriction sur chaque molécule. Lors de la ligation, le site de restriction est reproduit
- utiliser 2 enzymes différentes, mais produisant des extrémités compatibles. Lors de la ligation, le site de restriction n’est pas reproduit et ne peut donc par être reconnu par aucune des 2 enzymes
quelles sont les deux grandes catétégories de vecteurs plasmidiques et leur particularités
vecteurs de propagation : répliquer le vecteur en grande quantité dans une bactérie (destinées à amplifier un ADN particulier, ADN recombinant - gène d’intérêt inséré dans le plasmide n’est pas transcrit ou exprimé dans la cellule, possèdent une origine de réplication à haut rendement
vecteurs d’expression : permettent la transcription de l’ADN recombinant - gène d’intérêt inséré dans le plasmide, promoteur répond à la régulation génique, permet la production/synthèse de protéines dans notre espèce d’intérêt, permet l’ajout de régions supplémentaires aux ARN et protéines produites qui jouent un rôle de marqueurs, des marqueurs ou des étiquettes d’a.a peuvent être fusionnés à la protéine d’intérêt
quel est le lien entre l’origine de réplication et le nombre de copies du vecteur produit par chaque cellule
la facilité de l’ouverture de l’origine de réplication aura une influence sur le nombre de copies du vecteur produit par chaque cellule. Certains vecteurs sont limités à quelques copies (faible rendement), d’autre peuvent atteindre 500-1000 copies par bactérie (haut rendement)
les marqueurs de sélection sont généralement quoi
des gènes de résistance à un antibiotique - permettent d’isoler/sélectionner les bactéries ayant incorporé les vecteurs
il contient plusieurs sites de restriction pour l’insertion des fragments d’ADN
site de multiclonage
le fragment qu’on veut insérer et le vecteur doivent être coupés avec la même enzyme de restriction. Dans le cas où des enzymes différentes sont utilisées, que faut-il
elles doivent produire des coupures cohésives compatibles
processus par lequel les organismes récupèrent un ADN présent dans leur milieu extracellulaire
transformation
les bactéries étant capables de récupérer un ADN présent dans leur milieu extracell sont dites avoir quelle capacité naturelle
compétence génétique
si le vecteur se referme sur lui même, est-ce que le gène lacZ est toujours fonctionnel
oui, la protéine produit le composé de couleur bleue en présence de X-gal. Dans le cas contraire, l’insertion du gène d’intérêt directement dans le gène lacZ empêche l’expression de la protéine. Les colonies bactériennes seront blanches même en présence de X-gal
introduction d’un ADN étranger libre dans le milieu dans une cellule procaryote
transformation
introduction d’un ADN étranger dans une cellule eucaryote
transfection
transfert d’ADN entre bactéries par l’entremise de phages (virus)
transduction
qu’est-ce qui permet la transfection d’un organisme complexe
l’utilisation de souches bactériennes et plasmides recombinés adéquats
quels sont les deux types de transfection et leurs particularités
transitoire : l’ADN incorporé dans la cellule reste indépendant du génome. L’information génétique contenue peut être exprimée pendant un certain temps, mais sera éventuellement perdue et ne sera pas transmise pendant la division cellulaire
stable : une portion du plasmide s’intègre au génome de la cellule transfectée. Cette nouvelle information génétique est donc transmise lors des prochaines divisions cellulaires. Cela se fait généralement via des souches bactériennes compatibles à l’organisme
pour la transfection stable, quel plasmide et quelle bactérie sont généralement utilisés
plasmide Ti et Agrobacterium
outils génétiques utilsés par les bactéries pour se défendre contre les virus
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats - courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées)
comment fonctionne CRISPR
Il y a des fragments d’ADN viral qui ont été intégrés au génome de la bactérie sous forme de séquences d’ADN palindromiques répétées et groupées. Cet ADN finit par être transcrit en courtes molécules d’ARN qui s’associent à des endonucléases. Lors d’une prochaine infection virale (même virus), les protéines Cas, grâce au fragment d’ARN qu’elles portent reconnaîtront la séquence d’ADN du virus et l’inactiveront en coupant la molécule - la bactérie est immunisée !
explique comment le système CRISPR-Cas est utilisé pour modifier les génomes d’organismes de manière plus précise
on part du principe que si on donne un ARN guide complémentaire à n’importe quelle séquence génomique d’un organisme, l’endonucléase Cas 9 retrouvera la séquence-cible dans le génome et procédera à la coupure de l’ADN double-brin à cet endroit précis
qu’est-ce qu’on fait avec CRISPR-Cas9 : Cas9 coupe l’ADN double-brin à l’endroit indiqué par l’ARN guide et la réparation provoque une mutation
création de mutations
qu’est-ce qu’on fait avec CRISPR-Cas9 : avec deux ARN guides différents, Cas9 coupe l’ADN double-brin en 5’ et en 3’ d’un gène, puis les fragments d’ADN restants sont resoudés ensemble
enlever un gène
qu’est-ce qu’on fait avec CRISPR-Cas9 : Cas9 coupe l’ADN double-brin à l’endroit indiqué par l’ARN guide, puis une séquence spécifique (le nouveau gène) est ajoutée grâce à la réparation par recombinaison homologue
ajouter une gène à un endroit précis
qu’est-ce qu’on fait avec CRISPR-Cas9 : avec deux ARN guides différents, Cas9 coupe l’ADN double-brin en 5’ et en 3’ du segment à enlever, puis une séquence spécifique (le gène édité) est ajoutée grâce à la réparation par recombinaison homologue
éditer un gène
le résultat du séquençage est généralement lisible après quoi
la synthèse des premiers nucléotides par la polymérase, donc pas au niveau de l’amorce, mais plus loins en 3’ - les 15-20 premiers nucléotides à partir de l’amorce seront impossibles à lire (méthode de Sanger)
utilisés pour marquer la terminaison de la chaîne d’ADN à un point spécifique lors de la réaction de séquençage
les ddN - n’a pas le groupe OH nécessaire pour l’extension de la chaîne
quand tous les fragments d’un génome sont séquencés, quelle est l’étape suivante
l’assemblage
que cherche-t-on durant l’assemblage (séquençage)
on cherche les séquences superposées pour déterminer l’ordre dans lequel les fragments séquencés doivent être placés. La présence de régions répétées dans le génome peut rendre le processus difficile
permet d’amplifier le matériel génétique (génome) et de pouvoir séquencer ce matériel à l’aide d’une amorce connue (une amorce qui s’hybride sur le vecteur
banque d’ADN génomique
plusieurs méthodes de séquençage existent, mais toutes gardent une idée générale similaire, laquelle
séquencer en grande quantité de petits fragments et recréer ensuite la séquence complète en les superposant
permet la lecture automatique du résultat lors du séquençage
la séparation des fragments d’ADN par chromatographie sur colonne (mince capillaire)
l’utilisation des ____________________ a aussi permis d’améliorer l’efficacité de la technique : tous les nucléotides sont lus dans un même capillaire et le détecteur transmet l’amplitude de chaque fluorochrome
ddNTP-fluorescents
explique la transfection stable chez les animaux
La transfection stable chez les animaux est une technique de biologie moléculaire qui consiste à introduire de manière permanente un morceau d’ADN étranger, généralement un gène d’intérêt, dans le génome d’un animal. Voici comment cela fonctionne de manière simplifiée :
Choix de la cellule hôte : Tout d’abord, des cellules d’un animal, généralement des cellules embryonnaires ou des lignées cellulaires établies, sont choisies comme hôtes. Ces cellules deviendront les cellules porteuses du gène étranger.
Introduction de l’ADN étranger : L’ADN étranger, qui contient le gène d’intérêt, est introduit dans ces cellules hôtes à l’aide de techniques de transfert génétique, telles que l’utilisation de vecteurs viraux ou d’autres méthodes de transfection.
Sélection des cellules stables : Après l’introduction de l’ADN étranger, on utilise des marqueurs de sélection (généralement des gènes de résistance à des antibiotiques) pour identifier les cellules qui ont incorporé l’ADN étranger dans leur génome. Les cellules qui expriment avec succès le gène de résistance au marqueur de sélection survivent, tandis que les autres meurent.
Expansion et caractérisation : Les cellules qui ont intégré l’ADN étranger de manière stable sont ensuite cultivées et développées pour former une lignée cellulaire stable. Ces cellules contiennent le gène d’intérêt dans leur génome et peuvent être utilisées pour des expériences ultérieures, comme l’expression du gène, l’étude de sa fonction, etc.
La transfection stable chez les animaux permet d’étudier les fonctions des gènes ou de produire des modèles animaux transgéniques pour la recherche en biologie et en médecine. Elle est utilisée pour comprendre les mécanismes biologiques, développer des traitements médicaux, et bien d’autres applications. Cette technique est particulièrement importante pour la recherche biomédicale et la biologie moléculaire.
deux méthodes de transfection des cellules végétales
transfection des gamètes
formation de cals
les fleurs sont soumises à la transfection. Lors de la fécondation et de la formation de l’embryon, l’ADN recombinant inséré dans le génome sera transmis à toutes les cellules de la prochaine génération
transfection des gamètes
des sections de tissus sont soumises à la transfection. ces tissus sont ensuite cultivés sur un milieu qui induit la dédifférenciation des cellules. parmi ces cellules totipotentes, celles qui auront incorporé l’ADN recombinant dans leur génome seront sélectionneés. Il y aaura ensuite l’induction de la rédifférenciation des cellules en plantules. Une cellule différenciée deviendra une plante
formation de cals
gène s’insère dans le vecteur d’un seul sens, quel type de clônage
directionnel
v ou f, en général, aux extrémités de notre insert, il y a déjà un site de restriction
faux, il faut en insérer. on les insère sur les amorces en 5’
un plasmide est circulaire ou linéaire
ciculaire, si on coupe une fois, ça le rend linéaire, si on le fait migrer sur gel, on a 1 bande
quelle caractéristique doit posséder le vecteur
il doit avoir une origine de réplication reconnue par l’espèce qu’on étudie
quelles sont les séquences reconnues par la bactérie pour faire la recombinaison homologue dans le génome (pour transférer dans le génome)
border sequence : les séquences qui sont de chaque côté du gène qu’on veut insérer dans le génome
v ou f, dans la transfection transitoire, le vecteur ne s’incorpore jamais au génome
vrai, lorsque la cellule se divise, le vecteur est perdu
quelle transfection est utile pour visualiser où se trouve une protéine
transitoire (je bombarde mes cellules avec le vecteur, il y a expression qui se fait et dès que la cellule se divise je perds l’expression de ma protéine)
comment vérifier la présence et l’expression du gène (un exemple)
technique relative à l’expression : rtPCR
ARNm : produit de l’expression rétrotranscrit en ADN
quel est un grand avantage de CRISPR
on peut choisir le lieu d’insertion du transgène, je peux éviter de mettre mon transgène dans des régions codantes ou régulatrices
Il y a combien de transfections chez la plante avec CRISPR
2
