Chapitre 3 Flashcards
comment sont toujours commandées nos amorces (sens)
5’ vers 3’
comment faire pour trouver l’amorce anti-sens dans une séquence
reverse-complement
qu’est-ce que le nombre de cycles de PCR change au niveau du résultat obtenu
+ de cycle = + d’amplicon. Il n’y a pas de problème tant qu’on reste dans l’intervalle de 20-40 cycles pour ne pas être restreint dans nos réactifs
qu’est-ce qui détermine le choix de la température à l’étape d’élongation
l’enzyme, peu importe l’ADN
quel est le lien entre Tm et la température d’hybridation
si on chauffe trop, l’hybridation n’est pas stable, si ce n’est pas assez, ce n’est pas spécifique. Faut trouver une température d’hybridation idéale
introduction d’un gène étranger dans un génome
transgénèse
utilisée pour produire une grande quantité de copies d’une séquence d’ADN précise à l’aide d’une ADN polymérase
la PCR
par quoi est délimité la séquence d’ADN utilisée dans la PCR
les amorces utilisées
utilisée pour permettre la polymérisation des nouveaux brins à partir des nucléotides libres - résistante à des hautes températures
ADN polymérase
le maximum d’action de l’ADN polymérase se situe entre quelles températures
au delà de la température d’hybridation et en dessous de celle de la dénaturation
température optimum pour la Taq polymérase
72 degrés celcius
pour permettre la polymérisation en chaîne par quoi sont contrôlés les changements de température
thermocycleur
formule pour trouver Tm
2(A+T) + 4(C+G)
5 composantes de la PCR
ADN matrice
amorces (en fortes concentrations par rapport à celle de l’ADN à amplifier)
enzyme (ADN pol.)
tampon (spécifique de l’enzyme)
4 dNTP
quelles sont les trois étapes de chaque cycle de PCR
dénaturation, hybridation, élongation
définis l’étape de dénaturation de la PCR
augmentation de la température pour assurer la dénaturation de tous les brins d’ADN matrice ainsi que les amorces. l’ADN devient monocatenaire
définis l’étape d’hybridation de la PCR
diminution de la température pour permettre l’hybridation des amorces. Ces oligonucléotides vont marquer les extrémités de la séquences à amplifier (chaque amorce est complémentaire à une partie de la séquence matrice)
définis l’étape d’élongation de la PCR
les amorces fournissent les extrémités 3’OH nécessaires à l’activité de la polymérase. La température est ajustée à la température optimale pour l’enzyme et cette dernière polymérise alors le brin complémentaire à l’ADN matrice jusqu’à son extrémité ou jusqu’à ce qu’elle se détache de l’ADN matrice
définis l’étape de réaction en chaîne de la PCR
Les brins d’ADN nouvellement formés deviennent à leur tour ADN matrice et permettent l’augmentation exponentielle du nombre d’amplicons
formule pour le nombre d’amplicons (PCR)
2^n - 2n
qualitatif. permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Suite à la rétrotranscription de l’ARN en ADN, les mêmes étapes de la PCR sont effectuées. La visualisation du résultat permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle
RT-PCR
quantitatif. utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière bcp plus précise
qPCR
pour l’analyse de l’expression des gènes, que faut-il faire aux ARNm d’un organisme
ils sont d’abord isolés et ensuite rétrotranscrits en ADN à l’aide d’une rétrotranscriptase (RT)
applications de la PCR - identification de polymorphismes
il y existe plusieurs variantes d’un même gène dans la population
amplification et séquençage de la séquence d’intérêt afin d’identifier quel allèle particulier porte un individu donné (scènes de crime, test de paternité)
applications de la PCR - diagnostic d’infections
l’ADN trouvé dans un échantillon provenant d’un malade est amplifiée avec des amorces spécifiques pour les gènes viraux ou bactériens - amplification permet de détecter la présence du parasite - on peut trouver c’est quel parasite en séquençant l’ADN amplifié
applications de la PCR - diagnostics prénataux
échantillons d’ADN du foetus est prélevé, les séquences clés sont amplifiées et analysées - détection de maladies héréditaires ou des anomalies chromosomiques
si on veut étudier un gène particulier ou un segment défini d’ADN chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord…
être coupée en fragments de taille accessible (100 pb et 20 000 pb)
que sont des enzymes de restriction
des endonucléases capables de reconnaitre une séquence spécifique d’ADN et de cliver/couper l’ADN double brin à cet endroit
d’où proviennent les enzymes de restriction
des bactéries qui les utilisent pour éliminer tout ADN étranger. Leur propre ADN est protégé par méthylation sur les sites de restriction
les sites de restriction sont composés de combien de nucléotides
4-8
concernant les sites de restriction : leur séquence est identique sur les 2 brins lorsque lue de 5’ vers 3’, ils sont des
palindromes
quelles sont les chances des sites de restriction d’être présents plusieurs fois dans le génome
fortes chances, car sont très courts
types de coupures des enzymes de restriction
la coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types : franche ou cohésive
quelle coupure d’enzyme de restriction produit des extrémités libres qui sont simples brins
coupure cohésives
qu’est-ce qui permet de lier ensemble les extrémités libres produites par l’action des enzymes de restriction en formant des liaisons phosphoesters
ligases (permet donc de lier deux fragments d’ADN)