Chapitre 2 Flashcards
Qu’est-ce que la chromatographie?
Méthode utilisée afin de séparer des mélanges complexes
Qu’est-ce que la phase mobile?
Le mélange des substance à fractionner
Qu’est-ce que la phase stationnaire?
À travers de laquelle les substance seront séparées
Quelles sont les propriétés utilisées afin d’effectuer le fractionnement?
- Les interactions ioniques
- La taille
- La spécificité
L’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de quoi?
- Le pH de la solution, puisque la charge nette des protéines dépend du pH
- La concentration et la nature des autres ions en solution puisqu’ils vont également compétitionner pour le site de liaison de l’échangeur d’ions.
Quelles sont les deux caractéristiques des échangeurs d’ions?
- La nature de leur matrice
- Le groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine
Les matrices en chromatographie sont composées de quoi?
Polymères insolubles, préparés sous forme de billes (également appelées résines)
Quels sont les polymères les plus utilisés dans les matrices?
- La cellulose ou des dérivés de cellulose (agarose ou autres polymères)
- Perles céramiques rigides (silica)
Quelles sont les deux classes d’échangeurs?
1- échangeurs cationiques (charges négatives)
2- échangeurs anioniques (charges positives)
Quelles sont les groupements chimiques greffés sur les matrices?
1- QAE = amine quaternaire = anionique fort
2- Sulfonates = cationique fort
3- DEAE = amine tertiaire = anionique faible
4- CM = carboxyméthyle= cationique faible
Expliquer le principe de liaison à la colonne?
1- Les protéines se lient à l’échangeur grâce à des forces électrostatiques
2- Les charges de l’échangeur sont contre balancées par des contre-ions
3- La protéine doit déplacer ces contre-ions afin de s’attacher
4- Comme la protéine peut être neutralisée par les contre-ions, elle doit avoir une plus grande affinité pour l’échangeur d’ions que pour les contre-ions.
5- Régulation du pH et de la concentration saline afin que la protéine reste immobile à son échangeur
Expliquer le principe d’affinité des protéines avec l’échangeur d’ions (procédure de lavage)?
Les protéines qui n’ont pas d’affinité avec l’échangeur d’ions migreront en premier et se retrouveront en bas de la colonne.
Plus l’affinité est importante, plus la migration sera retardée
Quel est le moyen afin de procéder à l’élution (détachement) des protéines attachées à l’échangeur?
Utiliser une tampon ayant une concentration saline supérieur à celui du tampon de lavage
Quels sont les principaux sels utilisés afin de procéder à l’élution?
Le KCl et NaCl
Expliquer le principe de gradient linéaire?
Faire varier la concentration en sel présente dans le tampon de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne afin de libérer les protéines attachées à l’échangeurs d’ions
Qu’est-ce que la chromatographie par gel-filtration?
Sert à séparer les protéines selon leurs tailles à l’aide d’un tamis moléculaire.
VRAI OU FAUX
Les protéines plus petites passeront beaucoup plus rapidement à travers la colonne
FAUX
Ce sont les protéines les plus grandes, car elles seront exclus de la plupart des pores et se déplaceront plus rapidement à travers la colonne.
De quoi est constitué la phase stationnaire dans la chromatographie sur gel-filtration?
Un réseau de polymère réticulé possédant des pores
Qu’est-ce que la limite d’exclusion?
Les pores sont suffisamment gros afin de passer les petites protéines, mais empêcherait le passage des grosses protéines de certaines tailles.
De quoi sont faites les matrices?
Polymères insolubles à base de polysaccharides comme le dextrane, l’agarose, le polyacrylamide (préparées sous forme de billes réticulés)
La porosité du gel dépend de quoi?
1- de la masse moléculaire du polymère
2- du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules des polymères
Qu’est-ce que le volume d’élution d’une protéine?
C’est le volume de solvant nécessaire afin d’éluer une protéine après son dépôt sur la colonne
Que permet de mesurer le volume d’élution relatif (Ve/Vo)?
La masse moléculaire de la protéine
Quelle relation mathématique existe entre le volume d’élution relatif et le logarithme de la masse moléculaire de la protéine?
Une relation linéaire
Expliquer le principe de la dialyse?
Utilisation d’une membrane semi-perméable afin de séparer les molécules.
Elle permet d’éliminer les petites molécules comme les sels et les métabolites et garder les molécules les plus grosses
Dans quelle procédure de la purification des protéines la dialyse peut être importante?
Enlever les sels présent à la suite de la précipitation des protéines (salting-out).
Expliquer le principe de chromatographie d’affinité.
Un ligand va se lier à la protéine d’intérêt de manière covalente à une matrice poreuse et inerte.
Comment la protéine peut se détacher du ligand?
1- Ajouter un excès de ligand libre
2- Modifier la température, le pH ou la force ionique
Quelle est l’avantage de l’utilisation de la chromatographie d’affinité comparé aux autres méthodes chromatographiques?
Elle exploite les propriétés uniques de la protéine d’intérêt.
La constance de dissociation doit varier entre quelle valeur?
10^-4 et 10^-10
VRAI OU FAUX
La liaison du ligand avec sur la matrice ne doit pas interférer dans l’intéraction protéine-ligand
VRAI
La quantité de protéine retenue sur la colonne dépendra de quoi?
1- du Kd (interaction très faible si plus petit que 10^-4)
2- de la concentration de protéine dans l’extrait
3- du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration L-M)
Comment doit-être la matrice pour la chromatographie d’affinité?
1- Chimiquement inerte
2- Avoir une grande porosité
3- Présenter de nombreux groupements fonctionnelles qui permettront de créer des liaisons covalentes avec les ligands
Quel est polymère est le plus utilisé dans la matrice?
L’agarose
Comment se fait la liaison du ligand à la matrice d’agarose?
1- Réaction de l’agarose avec le bromure de cyanogène, produisant un intermédiaire stable et “activé”
2- le ligand réagit avec l’agarose pour donné un produit lié par covalent.
Que faire lorsque les protéines n’arrive pas à se lier au ligand couplé avec le bromure de cyanogène à cause de l’interférence stérique?
Un “bras” espaceur composé de 6C peut être ajouté
Quelles sont les méthodes utilisées afin de détecter les protéines présentes à la suite de la technique chromatographique?
1- Essaie enzymatique
2- Absorbance des protéines dans l’UV (280 nm)
3- Essai colorimétrique
4- Détection de la protéine sur gel SDS-PAGE
5- Détection de la protéine avec un anticorps
