Chapitre 1 Flashcards
Quel est la première étape lors de la purification des protéines?
Effectuer une dilution dans une phase liquide afin de libérer les protéines d’intérêt de la cellule (lyse cellulaire)
Quelles sont les deux options à concevoir lors de la rédaction d’un protocole pour l’étape de la lyse cellulaire?
1- Garder les protéines intactes (évaluer la fonction des protéines)
2- Dénaturer les protéines (pour l’extraction d’ADN ou d’ARN)
Quelles sont les différentes méthodes de désintégration mécanique?
1- Déchiquetage mécanique (blender)
2- Broyage avec du sable, de l’alumine ou des billes de verre de petite taille
3- Homogénéisateur
4- Rupture par haute tension (French Press)
5- Sonication par vibrateur ultrasonique
6- Cryolyse
Pourquoi l’utilisation du déchiquetage mécanique à l’aide d’un blender n’est pas recommandé?
Augmentation de la température ce qui peut avoir un impact sur la configuration des protéines (dénaturer potentiellement celles-ci)
Quelle est la méthode la plus douce et la plus simple afin de déchirer les cellules?
La lyse osmotique, où les cellules seront resuspendues dans un liquide hypotonique (solution dont la concentration molaire en
solutés est inférieure à la concentration molaire à l’intérieur de la cellule = création d’une pression osmotique)
Quelle est la particularité des liquides intra et extracellulaire du point de vue évolutif?
La vie étant née dans la mer primitive, les organismes qui se sont adaptés dans la vie hors de l’eau ont dans leur liquide intra et extra certains ions que l’on retrouve dans l’eau (K+, Na+, Mg2+, Cl-, Ca2+)
Quelle autre méthode doit-on utiliser pour lyser les cellules végétales?
Utilisation du lysosyme (enzyme qui dégrade la paroi cellulaire)
Comment appelle-t-on le produit à la suite de la dégradation des cellules?
Le lysat (centrifuger celle-ci afin d’enlever les particules et les débris cellulaires et conserver les protéines d’intérêt dans le surnageant)
Qu’est-ce que le SDS?
“Sodium dodecyl Sulfate” = un détergent anionique solide qui solubilise les protéines et les lipides de la membrane.
Aide les membranes à séparer et à exposer les chromosomes contenant l’ADN.
SDS libère l’ADN d’histones et d’autres protéines de liaison à l’ADN en les dénaturant.
Qu’est-ce que la protéinase K?
Une sérine protéase qui digère les protéines contaminantes lors de l’extraction d’ADN
L’intégrité structure des protéines et leur stabilité dépend de quoi?
La température, le pH, la présence de protéases
Quel est le pH physiologique?
6.5-7.5/8.0
La purification des protéines se fait généralement à quelle température?
0-5 ˚C
À quelle température pouvons-nous conserver les protéines?
-20 ˚C à -80 ˚C
Qu’est-ce que les protéases?
Enzymes qui dégradent les protéines (hydrolyse des liens peptidiques)
Qu’exploite les méthodes de fractionnement lors de la purification des protéines?
Les propriétés physico-chimiques afin de l’isoler progressivement des autres substances
Quelles sont ces propriétés physico-chimique?
La solubilité, la taille moléculaire, la charge ionique, la propriété d’absorption et de liaison à d’autres molécules biologiques
Quelle est la technique de séparation à utiliser pour étudier la solubilité?
La précipitation
La charge ionique?
- Chromatographie par échangeur d’ions
- Électrophorèse
- Focalisation isoélectrique
La taille moléculaire?
- Ultracentrifugation
- Chromatographie par gel-filtration
- Électrophorèse
La spécificité?
Chromatographie d’affinité
Que permet la couche d’hydratation?
Améliore la solubilité des macromolécules en réduisant l’attraction dipolaire-dipolaire inter-moléculaire et empêcher leur association avec d’autres solutés (couche d’eau ordonnée autour des régions hydrophobes)
La solubilité des protéines dépend de quoi?
- Interaction polaire entre les protéines et le solvant
- Interaction ionique avec les sels en solution
- Forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégat de charge similaire
Quelles sont les variations typiques qui sont utilisées afin de diminuer la solubilité des protéines?
1- La concentration saline
2- Le pH
3- L’ajout de solvant organique
4- Ajout de polymères inertes
Qu’arrive-t-il à la solubilité des protéines lorsque la concentration en sel est faible (salting-in)?
Les sels lient directement les protéines et éliminent leur charge nette, donc une augmentation de la solubilité.
Pourquoi cela augmente la solubilité?
1- Augmentation des interactions avec l’eau
2- Les sels augmentent la répulsion entre les protéines (diminution de la formation d’agrégat)
La solubilité des protéines dépend de quoi exactement?
De la nature des ions en solution et augmente généralement avec la concentration de sel
Expliquer le dessalage ou “salting-out”
Ajout d’une concentration élevée en sel favorisant la création d’agrégat.
Qu’est-ce qui explique la diminution de la solvatation des protéines?
L’hydratation des ions de sels a une forte tendance à séquestrer les molécules d’eau.
AB + (n1 + n2) * H2O ⇌ A+ * n1 H2O + B- * n2 H2O
Quels sont les deux types de sel?
1- Chaotropique
2- Kosmotropique
Chaotropique?
Ce sont des sels qui vont se lier directement aux protéines pouvant avoir un effet déstabilisant.
Kosmotropique?
Sels optimaux qui encouragent l’hydratation des régions hydrophiles et la déshydratation des régions hydrophobes sans avoir aucune interaction avec les protéines.
Quel est le sel le plus utilisé afin de précipiter les protéines?
La sulfate d’ammonium (NH4)2SO4
Qu’arrive-t-il à la solubilité au point isoélectrique? Pourquoi?
Diminution de la solubilité des protéines. La protéine a une charge nette de 0, ce qui diminue la répulsion électrostatique et augmente les forces électrostatiques globales.
Pourquoi l’ajout de solvant organique diminue le pouvoir solvatation de l’eau?
Puisqu’il diminue la constance diélectrique de l’eau
