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Bio 1153 > Chap 2: techniques miscroscope > Flashcards

Chap 2: techniques miscroscope Flashcards

1
Q

c’est quoi un artéfac?

A

structure artifcielle aparaissant lors de la préparation de l’échantillon pour son observation au microscope

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2
Q

une cause d’artéfacs

A

les fixateurs, qui causent la précipitation ou coagulation de substances normalement dépourvues de structures dans la cellule

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3
Q

comment prouver qu’une strcuture n’est pas un artéfac? (pas artificielle)

A
  • préparer les échantillons de diff. façons
  • différents fixateurs ou sans fixateurs (congélation rapide ou cryodécapage)
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4
Q

c’est quoi le grossissement efficace en microscopie?

A

amène + d’infos à partir du grossissement

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5
Q

c’est quoi le grossissement stérile? (problème grossissement efficace)

A

le grossisement n’apporte pas plus de détails utiles, car atteint une certaine limite de résolution (sert à rien d’augmenter indéfiniment le grossisement si limite résolution s’améliore pas en parallèle)

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6
Q

c’est quoi la limite de résolution?

A

expression quantitative de la capacité de grossissement efficace d’un appareil optique

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7
Q

comment est définie la limite de résolution (d)?

A

la + petite distance qu’on peut observer 2 points

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8
Q

quelle est la formule pour calculer la limite de résolution (d)?

A

d = 0.61λ / O.N. = 0.61λ / n sin α, où O.N. ouverture numérique et n indice de réfraction

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9
Q

Comment la diminution de la longueur d’onde affecte-t-elle la limite de résolution ?

A

elle améliore la limite de résolution (proportionnel)

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10
Q

quelles sont les solutions au problème du grossissement efficace? (donc améliorer limite de résolution)

A
  • En lumière visible
    en éclairant la préparation avk de courtes longueurs d’ondes (ex: lumière bleu)
  • En lumière ultraviolette
    microscope UV
    À 200 nm, on réussit à baisser de moitié la limite de résolution par rapport à la lumière visible (400 nm).
  • MET
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11
Q

Quels sont les inconvénients à utiliser la lumière ultraviolette

A

-Optique en quartz et non en verre qui est opaque aux U.V.
-Miroir à première surface (couche métallique non recouverte de verre)
-Invisible pour l’œil humain, donc faut faire développer

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12
Q

En quoi l’utilisation du MET améliore la limite de résolution?

A

en utilisant un faisceau d’éléctrons comme source d’éclairage

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13
Q

quelle est la formule pour calculer la longueur d’onde

A

λ (en nm)= h/mv = 1,23/ (V)^1/2

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14
Q

Quelles sont les contraintes du microscope électronique à transmission (MET) ?

A

-Faire le vide (préparations à l’avance)
-Préparations très minces (0,5 μm)
-Cellules mortes
-Coût élevé

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15
Q

Quels sont les avantages du MET par rapport aux autres microscopes ?

A

meilleure résolution et donc un grossissement efficace plus fort.

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16
Q

Quel est le processus de préparation des échantillons pour le MET ?

A

Les échantillons doivent être préparés très minces (0,5 μm) et peuvent être des cellules mortes.

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17
Q

Comment peut-on régler le problème de l’épaisseur des préparations en microscopie?

A

microtome et ultramicrotome

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18
Q

Quelle est la différence entre le microtome et l’ultramicrotome?

A

L’ultramicrotome coupe encore plus petit qu’un microtome.

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19
Q

Expliquez la préparation pour la coupe au microtome. (sans relief)

A

-Fixation: tuer les cellules dans le tissu
-Déshydratation: concentration croissante d’alcool (alcool remplace l’eau → intérieur devient hydrophobe)
-Intermédiaire: concentration croissante de toluène/xylène → toluène remplace alcool (+ hydrophobe que l’alcool)
-Inclusion: paraffine fondue (toluène remplacé par la paraffine)
-Spécimen incorporé dans la paraffine
-Microtome coupe et les coupes fusionnent avec la chaleur.

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20
Q

Expliquez la préparation pour la coupe au ultramicrotome.

A

-fixation avec Glutaraldéhyde et Tétroxyde d’osmium: mort des cellules dans le tissu

-déshydration avec concentration croissante alcool ou acétone.

-intermédiaire: oxyde de propylène

-incorporation du spécimen dans résine type epoxy

-polymériser dans un four.

-tailler (car trop dur) et mis dans l’ultramicrotome

-coupe avec du couteau en verre ou en diamant et tombe dans l’eau

-utilisation d’un porte spécimen pour l’observation au microscope.

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21
Q

Qu’est-ce que le cryodécapage ? (avec relief)

A

technique qui utilise le froid pour durcir les échantillons avant de les couper en tranches minces pour l’observation au microscope électronique.

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22
Q

Expliquer la préparation du matériel pendant le cryodécapage.

A

1- congélation dans l’azote liquide
2- fracture grâce à une microhache
3- sublimation pour accentuer la fracture (décapage)
4- ombrage: mélange de platine et de carbone
5- réplique: part au microscope

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23
Q

Comment peut-on résoudre le problème du contraste en microscopie photonique?

A

Fluorochromes
Colorants usuels
Cytoenzymologie

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24
Q

Qu’est-ce que la technique de coloration en fluorescence primaire ?

A

technique où l’on utilise des substances qui fluorescent naturellement

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25
Qu’est-ce que la technique de coloration en fluorescence secondaire ? (+ souvent)
technique de coloration où l’on utilise des substances qui doivent être colorées par les fluorochromes.
26
Quel est le système additif des couleurs primaires ?
Le système additif des couleurs primaires est le rouge, le vert et le bleu. * vert+rouge=jaune * vert+blue=cyan * bleu+rouge= magenta
27
Qu’est-ce qu’un fluochrome?
substance chimique capable de fluorescer, c’est-à-dire d’émettre de la lumière à une longueur d’onde spécifique lorsqu’elle est exposée à une autre longueur d’onde de lumière.
28
Qu’est-ce que l’immunofluorescence ?
C’est une technique de coloration où l’on utilise des anticorps pour marquer des molécules spécifiques.
29
Expliquez un processus de l’immunofluorescence.
-isoler les microtubules du cerveau de bovin -injection de tubulines purifiées et rappel dans un lapin (fait des anticorps contre la tubuline) -prise de sang -précipiter les anticorps ((NH₄)₂SO₄) -purifier les anticorps par affinité et ajouter des fluorochromes -traiter la cellule avec les anticorps fluorescents
30
Pour l’amélioration du contraste des préparations en photonique, quelles sont les approches pour les colorants usuels ?
-Approche empirique: Technique que l’on juge strictement d’après le résultat -Histocytochimie: Technique où l’on se questionne sur les raisons de la coloration (ex. Pourquoi un colorant colore-t-il une organelle différemment d’une autre?)
31
Expliquez la cytoenzymologie en photonique.
enzyme Substrat + Colorant -------------> Produit 1 + Produit 2 (complexe coloré)
32
Comment peut-on améliorer le contraste des préparations en microscopie électronique à transmission ?
-imprégnation métallique, -coloration négative, -ombrage, -cytoenzymologie, -immunocytochimie -immunocytoenzymologie.
33
Qu’est-ce que l’imprégnation métallique ?
dépôt de métaux lourds sur les membranes pour améliorer le contraste des préparations en microscopie électronique à transmission. (Pb, W, Os, Au...)
34
Expliquez l’imprégnation métallique.
-dépôt du tissus dans une solution de métaux lourds qui se déposent dans des endroits hydrophiles (membrane) -région sombre: endroit où les métaux lourds se déposent → électrons rebondissent, donc ne passe au travers les tissus et ne rejoignent pas le capteur. -région clair: endroit où les métaux lourds ne se déposent pas→ électrons passe au travers les tissus et rejoignent le capteur.
35
Qu’est-ce que la coloration négative ?
coloration de l’environnement du spécimen tridimensionnel (besoin de relief) on colore le milieu, ce qui entoure le spécimen La solution se dépose AUTOUR, virus pas coloré
36
Expliquez la coloration négative.
-Adsorption Virus (3D) sur la membrane. -déposer dans une solution avec métaux lourd qui se mettent sur la membrane -région claire: virus/spécimen -région sombre: membrane/environnement (électrons ne passent pas)
37
Qu’est-ce que la technique de l’ombrage
consiste à créer une ombre sur des structures tridimensionnelles pour les rendre plus visibles sous le microscope électronique.
38
Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des coupes à l’ultramicrotome ?
Non
39
Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des préparations obtenues par cryodécapage ?
oui
40
Peut-on utiliser la technique de l’ombrage sur des virus ?
oui
41
Donnez un exemple de cytoenzymologie
la réaction de Gomori
42
À quoi sert la réaction de Gomori?
mise en évidence des lysosomes dans les cellules prcq la rxn se fait dans les lysosomes (dépot de métaux lourds dedans)
43
Donnez des utilisations d’anticorps couplés
Immunocytochimie Immunocytoenzymologie
44
Comment fonctionne l’immunocytochimie ?
L’immunocytochimie utilise des anticorps couplés à la ferritine (protéine dense aux électrons, protéine de stockage du Fer dans le foie)
45
Comment fonctionne l’immunocytoenzymologie ?
L’immunocytoenzymologie utilise des anticorps couplés à des enzymes pour visualiser les antigènes spécifiques dans les cellules.
46
Quelles sont les 2 autres méthodes pour améliorer le contraste
-Méthodes basées sur l’éclairage (permettent l’observation contrastée de cellules vivantes) ex: microscope à champ sombre, contraste de phase, anneau de phase -Autoradiographie
47
Méthodes basées sur l'éclairage: Qu’est-ce que le microscope à champ sombre (fond noir) ?
-la lumière vient d’en bas et un diaphragme annulaire fait en sorte que la lumière déviée passe dans l’objet. -donc, l’objet ressort en clair, et le champs est sombre.
48
Donnez des exemples de contraste de phase.
Champ clair Contraste de phase Contraste interférentiel de Nomarski
49
Qu’est-ce que l’anneau de phase ?
dispositif qui déphase la lumière de λ/4
50
Qu’est-ce que l’autoradiographie ?
technique d’imagerie qui utilise des isotopes radioactifs pour marquer des molécules biologiques (utiliser en photonique et MET)
51
Quelles sont les alternatives à l’utilisation de l’autoradiographie
utiliser des films rayons X système d'imagerie des rayons beta
52
Expliquez l’autoradiographie
-incubation des cellules avec isotope radioactif -lavage (retirer les trucs pas radioactif dans cellule) -fixation -déshydratation, paraffine, microtome immersion dans une émulsion photographique liquide -développement en chambre noir
53
Expliquez l’autographie d’une cellule traitée à l’uridine radioactive
uridine présente dans ARN donc, +grains d’Ag → +uridine radioactive → donne l’endroit de où se passe la transcription (nodule)
54
Expliquez l’autographie d’une cellule traitée à la thymine radioactive.
-thymine = ADN, donc montre ADN sous forme de chromosome -mise en contact avec thymine radioactive, rentre dans l’ADN, réplication, observation de chromosome avec thymine radioactive
55
Qu’est-ce que le microscope électronique à balayage (MEB) ?
microscope électronique qui utilise un faisceau d’électrons qui balaye la surface du spécimen à observer (meilleur pour les structures 3D)
56
fonction centrifugation différentielle
aide à etudier certaines portions de la cellule
57
Expliquez le processus de la centrifugation différentielle en milieu homogène.
-cellule broyée avec un broyeur de Potter (force de cisaillement entre broyeur et paroi) -homogénat que l’on met dans une éprouvette -1er passage à la centrifugeuse: culot (noyau), surnageant (le reste des organelles plus petites) -2e passage à la centrifugeuse: culot (mitchondrie, lysosomes, peroxysomes), surnageant -3e passage à la centrifugeuse: culot (microsome rugueux), surnageant -4e passage à la centrifugeuse: culot (membrane du réticulum endoplasmique et ribosomes), surnageant (détergent: sodium deoxycholate)
58
Comment éviter la contamination par une autre organelle ?
faire un rincage
59
Qu’est-ce que l’équation de Stokes ?
décrit le déplacement d’une particule SPHÉRIQUE dans un champ gravitationnel. dx/dt= ((2r²(Dp-Dm))/9η)g où 2r²(Dp-Dm))/9η devient "s" donc dx/dt= sg
60
Qu’est-ce que le coefficient de sédimentation «s» ?
coefficient qui regroupe les facteurs de l’équation de Stokes pour former une estimation de: la taille, la densité et la forme d'une particule
61
de tous les facteurs, lequel importe le +?
la taille (ex. noyau + gros donc sédimente avant)
62
plus la valeur de s est élevé..
plus rapidement la particule sédimente
63
Quelle est l’unité de mesure utilisée pour la valeur “s” et sa valeur ?
L’unité Svedberg (S). 1E-13 seconde
64
Qu’est-ce que la centrifugation zonale ?
Une centrifugation basée sur éq. Stokes, mais où l’homogénat est déposé en surface d’un léger gradient de saccharose. si on laisse suffisamment de temps, l'ensemble des particules vont se trouver en bas
65
comment séparer des organelles qui ont le mm taux de sédimentation? ex: mitochondires, lysosomes
par centrifugation de densité
66
quels sont 2 types de gradients
gradient discontinu gradient continu
67
Quelle est la différence entre la centrifugation zonale et la centrifugation en gradient de densité ?
-centrifugation en gradient de densité basé uniquement selon la densité -centrifugation zonale basé sur éq. Stokes

Bio 1153 (6 decks)

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