CAP 18 Flashcards
Microscopios Ópticos
Dispositivos diseñados para observar estructuras que debido a su pequeño tamaño son invisibles al ojo humano
Estructura del MO de Campo brillante (común o convencional)
- Fuente de luz
- Espejo: refleja la luz
- Lente condensadora: concentra la luz hacia la muestra
- Espécimen: Muestra en estudio
- Lente objetivo: agranda la imagen
- Lente ocular: agranda más la imagen
Poder de Ampliación del MO
- Cap. del MO de dar imágenes grandes
- Depende del poder de:
Lente objetivo: hasta 100X
Lente ocular: 5X, 10X, 15X
Poder de ampliación útil máximo: 1500K
más allá de este poder es “Amplificación Vacía”
Poder de Resolución del MO
- Cap. del MO de dar imágenes nítidas
- Se mide inversamente calculando el “Límite de Resolución” (d) es la mínima distancia entre 2 puntos para discriminarlos como tales
A menor límite = Mayor poder de resolución
Cte. d= (0,61x long. de onda) / NA (apertura numérica)
MO de campo brillante sirve para ver
d promedio = 0,2 Mm (200nm)
- Tejidos
- Células
- Cromosomas
Visibilidad de la muestra
- Para MO de campo brillante necesitamos usar una sección de muestra tan delgada que es invisible y debe sufrir preparación:
1) Obtención: Muestra de 1cm3
2) Fijación: Se sumerje en formaldehído, alcohol o ác. acético (para conservarse). Esto MATA a la célula.
3) Deshidratación: Elimina H2O con alcohol
4) Inclusión: Agregado de parafina para endurecer
5) Corte: con un micrótomo para obtener láminas delgadas (5 Mm)
6) Aclaramiento: con benceno o tolueno
7) Tinción: con colorantes
8) Montura: la muestra se coloca entre 2 láminas de vidrio
- Arriba: Cubreobjeto
- Abajo: Portaobjeto
MO de Interferencia
- Posee lentes y prismas adicionales que permiten aprovechar el fenómeno de interferencia de ondas luminosas que permite generar brillos y contrastes sin necesitar tinción ni preparación alguna
- Sirven para estudiar células vivas
Tipos de MO de Interferencia
- MO de contraste de fases
- MO de Nomaski ( de interferencia diferencial o DIC )
- MO de interferencia con video y procesamiento de imagen
Microscopía de Fluorescencia
- Se utiliza el fenómeno de absorción de luz que presentan ciertos pigmentos para luego reflejar una luz de menor energía
- Poseen gran sensibilidad ( Detecta aun en bajas [ ] )
- Los figmentos con esta cap. se denominan fluorocromos o fluoróforos
Microscopía de Fluorescencia se emplea para
- Estudiar células vivas
- Se pueden marcar Prot. y ver su movimiento o detectar su presencia/localización
Para marcar Prot. — Anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes
Tipos de Fluorocromos
- Sintéticos: Rodamina y Fluorestina
Estos pigmentos pueden asociarse con anticuerpos a modo de aumentar su especifidad
Generalmente las prot. con anticuerpos pierden funcionalidad
- Naturales:
Medusa
* Aequorina
* GFP (Prot. verde fluorescente):
YFP — Amarilla
BFP — Azul
CFP — Cian
Anemona
* Ds Red
mOrange
mBanana
mTangerine
GFP
- Presenta una variante conocida como mCit
- La fluorescencia de la GFP se debe a un proceso autocatalítico en 3 de sus residuos (monomerica beta laminar)
Ds Red
- Prot. cuaternaria formada por 4 subunidades
- Sus variantes son Prot. monoméricas (No afectan la funcionalidad de las Prot.)
FRET (Transferencia de energía por resonancia de fluorescecia)
- Permite el estudio de cambios conformacionales en Prot. por medio de la detección de cambios en la luz emitida por la muestra
- Cuando la distancia entre 2 o más fluoroforos de 1 a 10 nm pueden transferir energía
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
Utiliza un haz de -e y un sistema de lentes (bobinas) electromagnéticas
Estructura
- Pistola o Cañón: Filamento de Tungsteno (Cátodo)
- Ánodo: con carga +
- Bobina condensadora
- Bobina Objetivo: muestra ahí
- Bobina proyectora
- Pantalla Fluorescente: transitoria
- Placa MIcrográfica: Permanente
Características
1) Poder de magnificación:
Objetivo: 100X
Proyectora: 200X
Total: 20 000X
2) Poder de Resolución: Depende de la long de onda del haz de -e que se calcula
long. de onda de -e = raíz de 150 / Voltaje
Voltaje: entre 10 000 y 100 000 V (gral. 60 000V)
Limite de resolucion: dreal = 10 a 15 °A
dpráctico = 3 °A (0,3nm)
3) Visibilidad: los -e atraviesan la muestra como si no existiera, por lo que la muestra es invisible y requiere preparación
Preparación de TEM
1) Obtención: Muestra de 1mm3
2) Fijación: *Glutaraldehído: Prot.
*Tetróxido de Osmio: Lípidos
3) Deshidratación: Elimina con etanol al 70, 95 y 100%
4) Inclusión: Se endurece la muestra con Polimerzación de Resinas Epóxicas o Acrílicas
5) Corte: con un micrótomo con cuchilla de vidrio o diamante
6) Aclaramiento: con Oxido de Propileno
7) Tinción y Montura: se tiñe o contrasta con metales pesados: Acetato de Uranilo y Citrato de Plomo
Los núcleos de los átomos pesados impiden el avance de los -e y así forman la imagen
Magnificación Vacía
- Si el poder de magnificación sobrepasa al poder de resolución:
- Imagen enorme
- No se distingue buen
Criofijación
Los fijadores se pueden desnaturalizar y precipitar prot y generar imágenes defectuosas llamadas “Artefactos”, por eso se utiliza este método que consiste en la congelación rápida en N líquido, He líquido, Propano líquido
Ventajas de la criofijación
- Más rápido
- Reemplaza fijación e inclusión en 1 solo paso
- Evita la formación de cristales de hielo
- No mata a la célula (Hibernación) — Sirve para conservar esperma, cigotos, células madre, etc.
- No desnaturaliza a las prot — ideal para conservar enzimas
Preparaciones especiales para TEM
1) Coloración especiales para TEM:
- P/ partículas como complejos multimoleculares o virus
- La muestra NO se “tiñe” con el contraste, por lo que colorea el entorno. Ej: Fosfotungstato
2) Modelo de sombra:
- También para partículas
- Se realiza un sombreado con Platino al vacío
- Da efecto 3D a la imagen
3) Criofractura (Congelación, Fractura, Replica)
- Es la mejor técnica para estudiar estructuras múltiples y complejos. Ej: MP
Pasos de Criofractura
1) Congelación: En N líquido a -170°
2) Fractura: Por “golpe de navaja” al vacío
3) Grabado: Sublimación al vacío en cámara fría a -40°C, donde se consigue resaltar los contornos
4) Evaporación:
*Rasante: Se agrega Platino en ángulo
*Vertical: Se deposita C sobre la muestra
Se genera un molde de C y Pt
Crioelectro tomografía (Crio - ET)
- otra técnica para TEM
- Se realiza una criofijacion sin corte ni fractura, luego de agregar los metales pesados, se elige una región delgada y se toman múltiples micrografias en distintos ángulos. Luego se hace una reconstrucción 3D de las imágenes tomadas
ME de Barrido (SEM)
- Es un microscopio diseñado para obtener imágenes 3D de la superficie de la muestra (no de su interior)
- Tiene gran profundidad de campo, por lo que puede observar nuestras gruesas, ej: insectos
- El límite de resolución ronda los 20 nm
Tipos de radiación
Todos los NM presentan radiación Beta excepto el Iodo (beta y gamma)
-Rayos alfa: equivalenyes al núcleo del He
- Rayos beta: equivalentes a 1ē
- Rayos gamma: equivalentes a 1 fotón
Vida media (t/2)
El tiempo que le toma a una muestra radiactiva perder la mirada de su masa por desintegración
Medida de la inestabilidad de un radioisotopo
Técnicas de Análisis
- Inmunoterapia
- Centellografía líquida
- Autorradiografia
Cultivo Celular
Método de obtención de muestras celulares
1) Cultivo Primario: las células se obtienen por extracción directa del tejido
2) Cultivo secundario: las células se obtienen de un cultivo previo
3) Cultivo de Línea: Utiliza células tumorales. Ej: HeLa
División celular
- Las células normales presentan un número limitado de divisiones posibles (50-100)
- Las células en línea presentan divisiones indefinidas, mientras el ambiente sea favorable
Fraccionamiento Celular
Método de separación o aislamiento de componentes que se vale de la fuerza centrífuga y de la densidad
- Fraccionamiento por centrifugación diferencial
- Fraccionamiento por Gradiente de densidad
Fraccionamiento Proteico
- Método de purificación o separación de Proteínas
- Cristalografía de Rayos X: análisis de proteína solubles
- Crio - EM y reconstrucción: Prot. Integrales
Método de Purificación o separación de Proteínas
1) Precipitación selectiva: se utiliza solo para hacer variar la solubilidad de las Prot.
2) Cromatografía líquida en columna
3) Espectrometría de masa
Trazador
Sustancia que revela presencia, se puede monitorear o localizar durante el curso de un experimento
Dependiendo de la Sust. Y tiempo. Puede estar marcado por:
Fluorescencia
Con giro
Con densidad
Radiactivamente
Vida media ejemplos
Tritio: 12,3 años
11C: 20 minutos
14C: 5700 años
45Ca: 152 días
Grupo marcado permite
Detectar una molécula sun afectar la especificidad de sus interacciones
Espectrometría de Centelleo Líquido
Para medir cantidad de radiactividad en una muestra
Autorradiografia
- Para determinar donde se localiza un isótopo particular
- Importante en los primeros descubrimientos sobre actividades sintéticas de la célula
- Aprovecha la cap. De la célula para activar una emulsión fotográfica, como rayos X o la luz en un trozo de película
Composición de meduos artificiales para el cultivo celular
Nutrientes, vitaminas, prot. Purificadas, insulina, factor de crecimiento epidérmico, transferrina
Cultivos primarios en células animales
Embriones
Disociación de tejidos
Con enzima proteolitica Tripsina
Cultivo Bidimensional
Las células se siembran en superficie plana de una placa preparada
Cultivo Tridimensional
Se cultivan en una matriz tridimensional de materiales extracelulares sintéticos o naturales
Más adecuados para estudiar interacciones entre células
Proporciona entorno más natural para células cultivadas
Se refleja en
- Dif.en la organización del citoesqueleto
- Tipos de diferencias celulares
- Actividades de señalización
- Estado de diferenciación
Células vegetales cultivadas
- Enzima celulasa digiere la pared ceular liberando la célula desnuda o Protoplasto
-Callos: Grupo de células indiferenciadas
Centrifugación Diferencial
- Aislamiento de un orgánulo particular en grandes cantidades
- Más densos van al fondo
- Peroxisomas, lisosomas, mitocondrias, cloroplastos
Velocidades de la ultracentrifuga
75 000 rpm = 500 000 veces gravedad
Cromatografía líquida en columna
- Aislarla en estado puro (sin contaminantes)
Fases:
- Fase móvil: Disolvente en movimiento
- Fase inmóvil: la matriz
Cromatografía de intercambio iónico
Depende de intercambio iónico depende de la unión de prot a un material inerte de la matriz
Resinas de Intercambio iónico
- Dietilaminoetil (DEAE) (+) Se une a moléculas (-)
- Carboximetil Celulosa (CM) (-) molécula (+)
Cromatografía de filtración en gel
Separa Proteínas o Ácidos Nucleicos en función a su tamaño efectivo en perlas de SEFADEX G-150 que se empaquetan en columna a través de la cual ma solución pasa
- Materiales compuestos por polisacáridos reticulados de dif porosidad DEXTRANOS o AGAROSA
Cromatografía de Afinidad
-Permite que una especie de prot. Se retire de la solución mientras que las demas permanecen
Prot que interactuan con Sust. Específicas
- Se logra la purificación casi total de la molécula en 1 solo paso
- Tb para purificar prot modificada con una marca en su N o C terminal
Marcas comunes
- TAP
- Glutation - S- transferasa (GST)
- His (6 his)
PAGE
Depende de la cap de moléculas cargadas para migrar cuando se colocan en un campo eléctrico
Prot impulsadas por una corriente aplicada a través de matriz gelificada de ACRILAMIDA
Para determinar masa molecular comparando posiciones
Electroforesis en gel bidimensional
- se utilizan 2 propiedades dif de las moléculas
- se separan en gel tubular mediante enfoque isoelectrico
- el gel se retira y se coloca en placa de poliacrilamida saturada con SDS y sujeto a SDS PAGE
- se separan mediante su masa molecular
- La resolución es alta
- ideal para detectar cambios en las proteínas en dif. Condiciones o en distintas etapas del desarrollo, ciclo celular o dif organismos
- No es adecuada para distinguir prot con masa elevada
Espectrometría
- Para determinar cantidad de proteínas o ácidos Nucleicos presentes en una solución
-mide la cantidad de luz de una longitud de onda específica absorbida por esa solución
- Instrumento: Espectrofotometro
Tirosina y Fenilalanina
Absorben la luz en el rango UV con máximo de absorbancia de 280nm
Mioglobina
- Primera proteína cuya estructura se determinó por difracción de rayos x se analizo a 6,2 y 1,4 A
- resolución de 6 a suficiente para demostrar como se pliega la cadena polipéptido
-no suficiente para mostrar la estructura dentro de la cadena
CCD
Detectores electrónicos altamente sensibles proporcionan una lectura digital de los datos de difracción han reemplazado de las placas fotográficas
- el uso de instrumentos con las computadoras cada vez más potentes permite recopilar y analizar datos suficientes para determinar la estructura terciaria de proteínas en cuestión de horas
Mayor desafío en la cristalografía de rayos X
Obtener cristales utilizables
La electroforesis en gel se puede usar para
- Separar moléculas con diferentes conformaciones, circulares, lineales, distendidas y súper enrollados
- para separar ácidos nucleicos de diferente masa molecular (longitud de nucleótidos)
- solo para moléculas pequeñas de rna o Dña de pocos cientos de nucleótidos o menos
- moléculas grandes no pasan por el gel de poliacrilamida
- la sensibilidad alta de la electroforesis en gel permite que las moléculas de RNA/DNA que se diferencian en un solo nucleótido se pueden separar entre sí
- Método invaluable para la secuenciación de ADN
Electroforesis de campo pulsado
- separación de moléculas de DNA mayores a 25 kb se fraccionan en gel de agarosa
- los fragmentos de DNA se visualizan con tincion de bromuro de etidio
Velocidad de sedimentación
- Velocidad a la que una molécula dada se mueve en respuesta a la fuerza centrífuga
- La la unidad S es igual a un coeficiente de sedimentación de 10-13 seg
Centrifugación de equilibrio
- Las moléculas de ácido nucleico se separan en función de su densidad de flotación
- se utiliza solución concentrada de la sal de metal pesado de cesio
- usada para separar moléculas de DNA que tienen composición de base diferente o isótopos de nitrógeno diferentes
Amplificación enzimática del DNA por PCR
- reacción en cadena de polimerasa
- utilizando transcriptasa inversa
Aplicación de PCR
1) amplificar el de enea para la clonación o el análisis
2) pruebas para la presencia de secuencias específicas de ADN
3) comparación de moléculas de ADN
4) cuantificación de las plantillas de ADN o ARN
