bloque II: criobiología Flashcards
qué tipo de célula se puede refrigerar
espermatozoides
qué tipo de célula se puede congelar rápidamente
espermatozoides
qué tipo de célula se puede congelar lentamente en equilibrio
espermatozoides y embriones
qué tipo de célula se puede vitrificar
ovocitos y embriones
temperatura de conservación en la refrigeración
4-5ºC
15ºC en porcino
objetivos refrigeración
previo IA como alternativa a la monta natural
especies en las que se utiliza la refrigeración
- equino
- porcino
estos 2 porque no tienen buenos resultados con la congelación - ovino - porque si se congela, la IA sería invasiva
en bovino la refrigeración se usa poco
verdadero
métodos para minimizar/proteger frente al shock por frío
- añadir protector/estabilizador de membrana al medio de refrigeración
- velocidad lenta de descenso de temperatura
añadir protector/estabilizador de membrana al medio de refrigeración
sustancias que no penetran la membrana que estabilizan la bicapa mejorando su fluidez
yema de huevo, leche descremada, caseínas
composición medio de refrigeración
- medio isotónico y tamponado
- protectores de membrana
- fuente de nutrientes y energía
- antibióticos
función del medio isotónico en los medios de refrigeración
- mantener pH neutro y presión osmótica adecuada
- proporcionar volumen adecuado de IA
función protectores de membrana
estabilizar membrana plasmática
proteger de shock por frío
los primeros cristales de hielo aparecen en el medio EC porque
- probabilidad de inicio de nucleación directamente relacionado con el tamaño del compartimento
- membrana actúa como barrera que detiene el proceso de nucleación
cuando el medio IC se deshidrata y aumenta la concentración de solutos, su punto crioscópico
desciende
la criorresistencia depende de…
elementos intrínsecos y extrínsecos
los elementos intrínsecos de los que depende la criorresistencia son
- relación superficie de membrana/volumen celular
- composición y permeabilidad
el área disponible de membrana para el intercambio con el medio EC es mayor en
espermatozoides>embriones>ovocitos
respecto a la criorresistencia, qué tiene que ver la composición de la membrana
en función del número, tipo y distribución de acuaporinas, las células serán más o menos resistentes al proceso de congelación
qué acuaporinas son importantes en la congelación y por qué
las acuagliceroporinas - permiten el paso de glicerol, que es el crioprotector más usado en congelación de semen
los elementos extrínsecos de la criorresistencia dependen de
el protocolo de congelación
elementos extrínsecos de criorresistencia son
- curva de descenso de Tº empleada
- tipo y concentración de crioprotectores
elementos extrínsecos: por qúe es importante la curva de descenso de Tº
porque a menor Tº menor permeabilidad - y si llega a hacerse impermeable se detiene el proceso de deshidratación, aumentando la probabilidad de formar cristales IC (porque hay agua dentro de la célula)
elementos extrínsecos: por qué es importante la concentración de crioprotectores
porque determinan la concentración que haya en el medio EC y por tanto el movimiento de gradiente (EC->IC o IC->EC)
según la velocidad de enfriamiento, ocurren 2 fenómenos
- formación de cristales IC
- estrés osmótico y deshidratación
formación de cristales de hielo IC ocurren porque…
cuando la Tº de descenso es muy rápida, no da tiempo a la célula a deshidratarse bien, de forma que cuando se llegue a la Tº de nucleación IC, el agua remanente que queda comienza a formar cristales de hielo, pudiendo dañar la célula
estrés osmótico y deshidratación ocurren porque…
cuando la velocidad de descenso es muy lenta, hay una deshidratación muy intensa, que provoca deformación celular y reducción de tamaño
cuando la velocidad de descenso de temperatura es muy lenta…
la célula de deshidrata mucho - deformación celular + reducción tamañ
cuando la velocidad de descenso de temperatura es muy rápida
la célula no se deshidrata bien: cristales IC
la velocidad de enfriamiento óptima es
aquella en la que los fenómenos de formación y de hielo IC, y el estés osmótico se minimizan, aumentando la posibilidad de supervivencia de la célula
crioprotectores no penetrantes tienen un peso molecular
alto
los crioprotectores no penetrantes ejercen su función:
- aumentando la concentración osmótica promoviendo el paso de agua del medio IC al EC
- desvitrificación/descongelación - se usan en pases/lavados de concentración decreciente para contrarrestar el hinchazón osmótico inicial (pasa agua muy rápido dentro de la célula)
crioprotectores no penetrantes más usados son
sacarosa
glucosa
PVP
PEG
los crioprotectores penetrantes tienen un PM
bajo - pasan la membrana
los crioprotectores penetrantes ejercen su función crioprotectora
- aumentar la osmolaridad IC - disminuye punto de congelación IC - menos cristales
- reducen el gradiente osmótico al que está sometido la célula: menor estrés osmótico
- disminuye la concentración de electrolitos IC por debajo de niveles tóxicos
- disminuye la concentración de agua
- aumenta viscosidad - menor movilidad de las moléculas de agua
todos los crioprotectores son tóxicos
FALSO - solo los penetrantes: citotóxicos
la citotoxicidad de los crioprotectores penetrantes es proporcional a
- tiempo de exposición
- temperatura de exposición
- concentración
los crioprotectores penetrantes más usados
- propanodiol PROH
- dimetilsulfóxido DMSO
- etilenglicol
- glicerol
daños celulares en el proceso de congelación
- 1º: refrigeración - shock térmico
-2º: cristales de hielo EC (daño mecánico) + IC (disfunción mecánica) además de: estrés osmótico, citotoxicidad y recristalización
el estrés osmótico y deshidratación se puede producir por
- cristales EC
- crioprotectores
- daño celular
el daño celular que se produce durante el estrés osmótico será:
- desnaturalización de proteínas + pérdida de lípidos
- pérdida de permeabilidad
- pérdida de la capacidad de expansión durante la rehidratación de la descongelación
la congelación usando vapores N2L es una congelación
rápida no en quilibrio
la congelación usando un biocongelador es
lenta programada en equilibrio
la congelación rápida se consigue usando
vapores N2L
la congelación usando vapores N2L se usa en especies como
para el semen de toro
la congelación con el biocongelador se usa para
embriones y espermatozoides, en ovocitos da malos resultados
qué tipo de proceso de conservación nos permite hacer el seeding
la congelación lenta en equilibrio programada usando un biocongelador
qué es el seeding
una inducción de la cristalización EC
el seeding solo se emplea para la congelación de
embriones, no semen
por qué usamos una descongelación rápida
para evitar la congelación durante el calentamiento o recristalización, es decir, que durante la descongelación, a medida que se vayan liberando las moléculas de agua, evitar que estas en lugar de quedar libres vayan a formar parte de un cristal de hielo ya formado, aumentando de tamaño y produciendo daño celular.
objetivo congelación semen
es la interrupción temporal del metabolismo del espermatozoide sin alterar su futura función fecundante
ventajas congelación semen
- creación bancos semen - peligro de extinción + estirpes/líneas de interés
- sanidad
- facilidad de transporte
desventajas congelación semen
- mayor coste congelación que refrigeración
- daños celulares - shock, citotoxicidad, estrés osmótico y recristalización
- fertilidad semen congelado menor que refrigerado
objetivo criopreservación de ovocitos y embriones
interrupción temporal del embrión/ovocito sin pérdida de su futura capacidad de desarrollo
ventajas criopreservación de ovocitos y embriones
- sanidad
- importación/exportación
- bancos de germoplasma
desventajas criopreservación de ovocitos y embriones
- daños celulares comunes spz: alteración en viabilidad celular + daños en la cromatina
- daños específicos -
daños específicos en la criopreservación de ovocitos y embriones
- mayor riesgo de cristales IC por su baja relación de superficie de membrana/volumen celular
- depolimerización en ovocitos metafase II + aneuploidías por presencia de huso mitótico
requisitos para vitrificación
- velocidad de enfriamiento muy rápida
- poco volumen de muestra
- elevada osmolaridad
daños celulares en vitrificación
- elevada citotoxicidad
- mayor estrés osmótico y deshidratación
las concentraciones de crioprotectores en vitrificación y congelación son los mismos
FALSO - mayor en vitrificación
