Biochimica

Question 1

Quale ione è necessario per l’attività di PNPasi?
o Cl -
o NH 4+
o PO4 3-
o Fe 3+

Answer 1

PO4 3- in quanto l’attività della PNPasi è catalizzare due tipologie di reazioni:
1. Fosforolisi di poliribonucleotidi
Polimerizzazione di poliribonucleosidi difosfato
Per cui sono necessari dei gruppi fosfato affinchè possa catalizzare la reazione.

Question 2

Il materiale di partenza del laboratorio di biochimica:
o Estratto di citoplasma
o Risospensione di cellule batteriche
o Miscela di proteine note
o Soluzione di enzima puro

Answer 2

Risospensione di cellule batteriche

Question 3

La colonna cromatografica serve per:
o Purificare la proteina di interesse
o Eliminare la PNPasi
o Caratterizzare la proteina di una miscela
o Quantificare la proteina con His-tag

Answer 3

Purificare la proteina di interesse

Question 4

Come è stata clonata la PNPasi per la purificazione?
o Senza tag
o Con His-tag
o Con FLAG-tag
o In fuzione con GST

Answer 4

Con His-tag.
La purificazione avviene attraverso la cromatografia per affinità. Viene utilizzato uno ione bivalente contenente cobalto e legato alla matrice cromatografica, in grado di legare 6 istidine della proteina di interesse; ciò comporta il legame alla matrice della proteina stessa.

Question 5

La purificazione mediante cromatografia di affinità consente di separare le molecole in funzione di:
o Idrofobicità
o Dimensione e forma
o Legame specifico tra due molecole
o Forza ionica

Answer 5

Legame specifico tra du molecole; in questo caso, proteina (His-tag) e ione bivalente con cobalto e nickel.

Question 6

L’attività enzimatica della PNPasi è tipicamente monitorata attraverso:
o Assorbimento spettroscopico dell’enzima
o Emissione della fluorescenza dell’enzima
o Assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione
o Misura del peso molecolare dell’enzima

Answer 6

Assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione

Question 7

La PNPasi viene recuperata dopo la centrifugazione sfruttando il fatto che:
o È una proteina citoplasmatica
o È una proteina di membrana
o Aggrega e si deposita nel pellet
o È stata secreta dalle cellule

Answer 7

È una proteina citoplasmatica.

Question 8

Per determinare la concentrazione proteica di un campione incognito occorre costruire una retta di taratura riportando:
- In ascissa i valori di assorbimento a 595nm e in ordinata i corrispondenti ug di proteina
- In ascissa il volume aggiunto in cuvetta e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm
- In ascissa i ug di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm
- In ascissa i ul di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm

Answer 8

In ascissa i microgrammi di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595 nm.

Question 9

In seguito alla purificazione, ci si aspetta che la resa proteica:
o Sia aumentata per la perdita di contaminanti
o Sia diminuita per la perdita di contaminanti
o Sia diminuita per la perdita di materiale non proteico
o Sia aumentata per la perdita di PNPasi

Answer 9

Sia diminuita per la perdita di contaminanti

Question 10

Il grafico dei doppi reciproci:
o Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse indipendente dalla vmax
o Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse uguale a Km/vmax
o Ha una pendenza indipendente da Km
o Ha una pendenza tanto maggiore quanto maggiore vmax

Answer 10

Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse indipendente dalla Vmax

PENDENZA= Km/Vmax
Intercetta ascisse = -1/Km
Intercetta ordinate= 1/Vmax

Question 11

L’His-tag della proteina si lega alla resina della colonna di purificazione grazie alla presenza di:
o Estratto grezzo
o Ioni cobalto
o Eluati
o Imidazolo

Answer 11

Ioni cobalto.
Utilizziamo una resina con affinità per la fase stazionaria della colonna cromatografica che permette di legare tramite i suoi ioni cobalto la proteina, che quidni verrà trattenuta nella matrice.

Question 12

Quale dei seguenti parametri dipende dalla concentrazione dell’enzima?
o Km
o Numero di turnover
o k1
o Vmax

Answer 12

Vmax

Question 13

Definisci l’estratto grezzo:
o L’insieme delle proteine che non si legano alla colonna
o L’insieme delle proteine ottenute tramite purificazione
o L’insieme delle proteine eluite dalla colonna
o Il contenuto delle cellule in seguito alla lisi

Answer 13

Il contenuto delle cellule in seguito alla lisi

Question 14

Nell’estratto grezzo è presente:
o Il substrato della reazione catalizzata da PNPasi
o Solo la proteina da purificare
o Contenuto della cellule
o Tutte le proteine ad eccezione di quelle da purificare

Answer 14

Contenuto della cellula.

Question 15

Per eluire la PNPasi dalla colonna, occorre aggiungere:
o Acqua
o Eluati
o Imidazolo
o Tampone di lisi

Answer 15

Imidazolo (competitor del cobalto, lo sbaraglia e permette l’eluizione)

Question 16

Il volume del campione da aggiungere a 1ml di reattivo di Bradford deve essere:
o < 10microlitri
o > 100microlitri
o > 500microlitri
o < 1microlitro

Answer 16

< 10 microlitri (1:100)

Question 17

Il picco di assorbanza del Coomassie Brilliant Blue è:
o 100nm
o 280nm
o 595nm
o 340nm

Answer 17

595 nm

Question 18

L’intensità della banda su un gel SDS-PAGE dipende:
o Dal tampone usato per la corsa elettroforetica
o Dalla quantità di proteina presente
o Dalla quantità di beta-mercaptoetanolo nel sample buffer
o Dalla complessità del campione in esame

Answer 18

Dalla quantità di proteina presente

Question 19

Per visualizzare le proteine su gel di poliacrilammide al termine della corsa, si utilizza:
o Anticorpo 2°
o Anticorpo 1°
o Colorante Coomassie Blue
o Imidazolo

Answer 19

Colorante Coomassie blue

Question 20

L’unità enzimatica internazionale U:
o Viene normalmente determinata determinando il contenuto proteico totale del preparato in esame
o È definita come la quantità di moli di prodotto formate al minuto, nelle condizioni del test, dall’enzima che si sta dosando
o Divisa per il volume della miscela di reazione in ml dà la velocità di reazione
o Viene normalmente determinata misurando la velocità di reazione in diverse condizioni

Answer 20

Divisa per il volume della miscela di reazione in mL da la velocità di reazione.
L’unità enzimatica identifica la quantità di un enzima che catalizza la conversione di 1 micromole di S in un minuto.

Question 21

A concentrazione di substrato saturante:
o La velocità di reazione varia al variare della concentrazione di enzima
o La reazione ha raggiunto l’equilibrio chimico
o La velocità di reazione non varia al variare della concentrazione di enzima
o La velocità di reazione è semimassimale

Answer 21

La velocità di reazione varia al variare della concentrazione di enzima

Question 22

Quale di questi composti viene utilizzato per ottenere l’estratto grezzo?
o RNAsi 0,5M
o Fosfato
o Tampone di lisi
o Imidazolo

Answer 22

Tampone di lisi

Question 23

Quale scopo ha avuto la centrifugazione durante il lab?
o Promuovere la lisi cellulare
o Recuperare proteine secrete dalla cellula
o Miscelare opportunamente la soluzione di cellule
o Separare la frazione solubile da quella insolubile

Answer 23

Separare la frazione solubile da quella insolubile

Question 24

Definisci l’attività sperimentale di biochimica:
o Purificare e determinare l’attività enzimatica di una proteina
o Determinare l’attività enzimatica di una proteina con diversi substrati
o Purificazione e determinazione della struttura della proteina
o Determinazione della struttura 3° di una proteina, e la sua attività enzimatica

Answer 24

Purificare e determinare l’attività enzimatica di una proteina

Question 25

Il gradiente discontinuo di imidazolo viene usato per: o Rompere la membrana cellulare o Eluire la proteina purificata dalla colonna o Ottenere l’estratto grezzo o Lavare la colonna

Answer 25

Eluire la proteina purificata dalla colonna.

Question 26

Il picco/volume escluso, è costituito da: o Eluati o Proteine che non si legano alla colonna o PNPasi o PNPasi e proteine che non si legano alla colonna

Answer 26

Proteine che non si legano alla colonna.

Question 27

Quale di queste tecniche è comunemente usata per il dosaggio proteico: o SDS-PAGE elettroforesi o Metodo di Bradford o Cromatografia ad affinità o Western blot

Answer 27

Metodo di Bradford

Question 28

Il reattivo di Bradford contiene: o Fosfato o Imidazolo o Coomassie Brilliant Blue o BSA

Answer 28

Coomassie Brilliant Blue

Question 29

Il reattivo di Bradford reagisce con: o His-tag o Imidazolo o Proteine in soluzione o SDS aggiunto al campione

Answer 29

Proteine in soluzione

Question 30

Il metodo di Bradford è: o Lineare a qualsiasi concentrazione o Parabolico o Lineare da 10 a 100 microgrammi di proteina o Lineare in breve intervallo di concentrazioni

Answer 30

Lineare in breve intervallo di concentrazioni

Question 31

La migrazione delle proteine nell’SDS-PAGE permette di determinare: o Lunghezza della sequenza aa della proteina o Carica superficiale della proteina o MM della proteina o Idrofobicità della sequenza aa della proteina

Answer 31

Mm

Question 32

Nel Western blot l’Ab 2° riconosce specificamente: o Il latte usato per saturare o L’Ab 1° specie-specifico o La proteina trasferita su filtro o L’SDS

Answer 32

L’Ab 1^ specie -specifico

Question 33

La determinazione sperimentale della Km richiede: o Misure di v a concentrazione saturante di substrato o Misure di velocità a diverse concentrazioni di substrato o Conoscenza esatta della concentrazione di enzima nelle miscele di reazione usate per misurare la v o Misure di v a diverse concentrazioni di enzima

Answer 33

Misure di velocità a diverse concentrazioni di substrato.

Question 34

Il grafico dei doppi reciproci: o Ha pendenza tanto maggiore quanto maggiore la vmax o Ha intercetta sulle ascisse uguale a Km/vmax o Ha intercetta sulle ascisse indipendente da vmax o Ha pendenza indipendente da Km

Answer 34

Ha intercetta sulle ascisse indipendente da Vmax

Question 35

Cosa si intende per saggio accoppiato di attività enzimatica? o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima saturante o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima il cui prodotto non è spettrofotometricamente misurabile o Un metodo di dosaggio in cui si segue direttamente la reazione catalizzata dall’enzima in esame o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima limitante

Answer 35

Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima saturante

Question 36

L’unità di misura della vmax è: o Mg min -1 o mM min-1 o mM min o mg min-1

Answer 36

mM/ min

Question 37

A concentrazioni di substrato saturante: o La v di reazione è semimassimale o La v di reazione varia al variare della concentrazione di enzima o La v di reazione non varia al variare della concentrazione di enzima o La reazione ha raggiunti l’equilibrio

Answer 37

La V di reazione varia al variare della concentrazione di enzima.

Question 38

Come si calcola l’indice di purificazione? o Rapporto tra attività enzimatica U/ml di ciascun passaggio di purificazione, e quella del 1° o Rapporto tra attività specifica U/mg di ciascun passaggio, e quella del 1° o Rapporto tra attività specifica U/mg di ciascun passaggio, e quella del 1° , moltiplicando x100 o Rapporto tra concentrazione proteica mg/ml di ciascun passaggio, e quella del 1°

Answer 38

Rapporto tra attività specifica U/mg si ciascun passaggio, e quella del 1°

Question 39

Quale di queste è una tecnica comunemente usata per purificare le proteine: o Western blot o Cromatografia di affinità o Metodo di Bradford o HPLC

Answer 39

Cromatografia di affinità.

Question 40

Il numero di molecole del reattivo di Bradford è proporzionale a: o Volume della soluzione aggiunta o Numero di proteine presenti in soluzione o Imidazolo in soluzione o pH della soluzione

Answer 40

Numero di proteine presenti in soluzione.

Question 41

Il detector dello spettrofotometro misura. o La luce assorbita o L’intensità della luce incidente o L’intensità della luce trasmessa o La velocità di reazione

Answer 41

L’intensità della luce trasmessa

Question 42

L’SDS-PAGE avviene: o A pH 4 o A pH 10 o In condizioni denaturanti o In condizioni non denaturanti

Answer 42

In condizioni denaturanti.

Question 43

Quale di queste affermazioni è vera? o pH stacking gel > pH running gel o pH stacking = pI della proteina di interesse o pH stacking < pH running o pH stacking = pH running

Answer 43

PH stacking

Question 44

Il sodio dodecilfosfato, SDS, è: o Il substrato della reazione catalizzata da PNPasi o Il colorante reattivo di Bradford o Una molecola anfifilica che si lega alle proteine o Un tampone

Answer 44

Una molecola anfifilica che si lega alle proteine.

Question 45

Il molecular weight marker usato in SDS-PAGE è composto da: o Sodio dodecil fosfato a diverse concentrazioni o Miscela di proteine incognite o Glicerolo a diverse concentrazioni o Miscela di proteine note

Answer 45

Miscela di proteine note.

Question 46

L’unità di misura della Km è una concentrazione in: o mM-1 o mM o mg/ml o U

Answer 46

mM

Question 47

La Km: o Varia al variare della concentrazione di enzima o Più è elevata, minore è la concentrazione di substrato necessaria per saturare l’enzima o Ha le unità di misura della concentrazione o È pari alla velocità di reazione quando l’enzima è semisaturo

Answer 47

Ha le unità di misura della concentrazione

Question 48

Assorbanza e concentrazione sono legate tra loro dalla: o Equazione di Michaelis e Menten o K o Vmax o Legge di Lambert-Beer

Answer 48

Legge di Lambert-Beer

Question 49

Il filtro di nitrocellulosa nel Western blot serve a: o Quantificare le proteine separate sul gel o Calcolare la massa molecolare delle proteine o Separare le proteine in base alla massa molecolare o Trasferire le proteine separate tramite elettroforesi

Answer 49

Trasferire le proteine separate tramite elettroforesi.

Question 50

Nel western blot le proteine sul filtro di nitrocellulosa si legano a: o Fluoro foro o Ab 2° o Ab specifico o Fosfato

Answer 50

Ab specifico.

Question 51

Un enzima è definito come una proteina che: o Accelera solo la reazione diretta o Accelera solo la reazione inversa o Viene modificata al termine della reazione o Accelera la reazione stabilizzando lo stato di transizione

Answer 51

Accelera la reazione stabilizzando lo stato di transizione.

Question 52

Come si calcola l’attività specifica di un enzima? o Unità totali di enzima / concentrazione della proteina o Mg di proteina del campione x volume del campione o Unità di enzima del campione x volume del campione o Unità totali di enzima / quantità totale di proteine in mg

Answer 52

Unità totali di enzima/quantità totale di proteine in mg

Question 53

Disporre in ordine di esecuzione le seguenti fasi della purificazione IMAC: - Eluizione - Impaccamento - Caricamento del campione - Equilibrazione - Lavaggio

Answer 53

2-4-3-5-1 Impaccamento - equilibrazione - Caricamento del campione - Lavaggio - Eluizione

Question 54

L’attività enzimatica della PNPasi viene tipicamente monitorata attraverso: - La misura del peso molecolare dell’enzima - L’assorbimento spettroscopico dell’enzima - L’emissione di fluorescenza dell’enzima - L’assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione

Answer 54

L’assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione.

Question 55

Come si calcola la resa di una purificazione? - Calcolando il rapporto tra le unità totali di enzima (U) di ciascun passaggio e quelle del primo passaggio - Calcolando il rapporto tra l’attività enzimatica (U/ml) di ciascun passaggio e quella del primo passaggio e moltiplicando per 100 - Calcolando il rapporto tra le unità totali (U) di enzima di ciascun passaggio di purificazione e quelle del primo passaggio e moltiplicando per 100 - Calcolando il rapporto tra l’attività specifica (U/mg) di ciascun passaggio e quella del primo passaggio e moltiplicando per 100

Answer 55

Calcolando il rapporto tra le unità totali (U) di enzima di ciascun passaggio di purificazione e quelle del primo passaggio e moltiplicando per 100

Question 56

Durante la purificazione per affinità la fase di impaccamento serve a: - caricare l’estratto grezzo in colonna - Raccogliere il picco escluso - Allontanare tutte le proteine che si sono legate debolmente alla resina - collocare la fase stazionaria all’interno della colonna cromatografica

Answer 56

Collocare la fase stazionaria all’interno della colonna cromatografica.