Biochimica Flashcards
Quale ione è necessario per l’attività di PNPasi?
o Cl -
o NH 4+
o PO4 3-
o Fe 3+
PO4 3- in quanto l’attività della PNPasi è catalizzare due tipologie di reazioni:
1. Fosforolisi di poliribonucleotidi
Polimerizzazione di poliribonucleosidi difosfato
Per cui sono necessari dei gruppi fosfato affinchè possa catalizzare la reazione.
Il materiale di partenza del laboratorio di biochimica:
o Estratto di citoplasma
o Risospensione di cellule batteriche
o Miscela di proteine note
o Soluzione di enzima puro
Risospensione di cellule batteriche
La colonna cromatografica serve per:
o Purificare la proteina di interesse
o Eliminare la PNPasi
o Caratterizzare la proteina di una miscela
o Quantificare la proteina con His-tag
Purificare la proteina di interesse
Come è stata clonata la PNPasi per la purificazione?
o Senza tag
o Con His-tag
o Con FLAG-tag
o In fuzione con GST
Con His-tag.
La purificazione avviene attraverso la cromatografia per affinità. Viene utilizzato uno ione bivalente contenente cobalto e legato alla matrice cromatografica, in grado di legare 6 istidine della proteina di interesse; ciò comporta il legame alla matrice della proteina stessa.
La purificazione mediante cromatografia di affinità consente di separare le molecole in funzione di:
o Idrofobicità
o Dimensione e forma
o Legame specifico tra due molecole
o Forza ionica
Legame specifico tra du molecole; in questo caso, proteina (His-tag) e ione bivalente con cobalto e nickel.
L’attività enzimatica della PNPasi è tipicamente monitorata attraverso:
o Assorbimento spettroscopico dell’enzima
o Emissione della fluorescenza dell’enzima
o Assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione
o Misura del peso molecolare dell’enzima
Assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione
La PNPasi viene recuperata dopo la centrifugazione sfruttando il fatto che:
o È una proteina citoplasmatica
o È una proteina di membrana
o Aggrega e si deposita nel pellet
o È stata secreta dalle cellule
È una proteina citoplasmatica.
Per determinare la concentrazione proteica di un campione incognito occorre costruire una retta di taratura riportando:
- In ascissa i valori di assorbimento a 595nm e in ordinata i corrispondenti ug di proteina
- In ascissa il volume aggiunto in cuvetta e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm
- In ascissa i ug di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm
- In ascissa i ul di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595nm
In ascissa i microgrammi di proteina e in ordinata i corrispondenti valori di assorbimento a 595 nm.
In seguito alla purificazione, ci si aspetta che la resa proteica:
o Sia aumentata per la perdita di contaminanti
o Sia diminuita per la perdita di contaminanti
o Sia diminuita per la perdita di materiale non proteico
o Sia aumentata per la perdita di PNPasi
Sia diminuita per la perdita di contaminanti
Il grafico dei doppi reciproci:
o Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse indipendente dalla vmax
o Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse uguale a Km/vmax
o Ha una pendenza indipendente da Km
o Ha una pendenza tanto maggiore quanto maggiore vmax
Ha un’intercetta sull’asse delle ascisse indipendente dalla Vmax
PENDENZA= Km/Vmax
Intercetta ascisse = -1/Km
Intercetta ordinate= 1/Vmax
L’His-tag della proteina si lega alla resina della colonna di purificazione grazie alla presenza di:
o Estratto grezzo
o Ioni cobalto
o Eluati
o Imidazolo
Ioni cobalto.
Utilizziamo una resina con affinità per la fase stazionaria della colonna cromatografica che permette di legare tramite i suoi ioni cobalto la proteina, che quidni verrà trattenuta nella matrice.
Quale dei seguenti parametri dipende dalla concentrazione dell’enzima?
o Km
o Numero di turnover
o k1
o Vmax
Vmax
Definisci l’estratto grezzo:
o L’insieme delle proteine che non si legano alla colonna
o L’insieme delle proteine ottenute tramite purificazione
o L’insieme delle proteine eluite dalla colonna
o Il contenuto delle cellule in seguito alla lisi
Il contenuto delle cellule in seguito alla lisi
Nell’estratto grezzo è presente:
o Il substrato della reazione catalizzata da PNPasi
o Solo la proteina da purificare
o Contenuto della cellule
o Tutte le proteine ad eccezione di quelle da purificare
Contenuto della cellula.
Per eluire la PNPasi dalla colonna, occorre aggiungere:
o Acqua
o Eluati
o Imidazolo
o Tampone di lisi
Imidazolo (competitor del cobalto, lo sbaraglia e permette l’eluizione)
Il volume del campione da aggiungere a 1ml di reattivo di Bradford deve essere:
o < 10microlitri
o > 100microlitri
o > 500microlitri
o < 1microlitro
< 10 microlitri (1:100)
Il picco di assorbanza del Coomassie Brilliant Blue è:
o 100nm
o 280nm
o 595nm
o 340nm
595 nm
L’intensità della banda su un gel SDS-PAGE dipende:
o Dal tampone usato per la corsa elettroforetica
o Dalla quantità di proteina presente
o Dalla quantità di beta-mercaptoetanolo nel sample buffer
o Dalla complessità del campione in esame
Dalla quantità di proteina presente
Per visualizzare le proteine su gel di poliacrilammide al termine della corsa, si utilizza:
o Anticorpo 2°
o Anticorpo 1°
o Colorante Coomassie Blue
o Imidazolo
Colorante Coomassie blue
L’unità enzimatica internazionale U:
o Viene normalmente determinata determinando il contenuto proteico totale del preparato in esame
o È definita come la quantità di moli di prodotto formate al minuto, nelle condizioni del test, dall’enzima che si sta dosando
o Divisa per il volume della miscela di reazione in ml dà la velocità di reazione
o Viene normalmente determinata misurando la velocità di reazione in diverse condizioni
Divisa per il volume della miscela di reazione in mL da la velocità di reazione.
L’unità enzimatica identifica la quantità di un enzima che catalizza la conversione di 1 micromole di S in un minuto.
A concentrazione di substrato saturante:
o La velocità di reazione varia al variare della concentrazione di enzima
o La reazione ha raggiunto l’equilibrio chimico
o La velocità di reazione non varia al variare della concentrazione di enzima
o La velocità di reazione è semimassimale
La velocità di reazione varia al variare della concentrazione di enzima
Quale di questi composti viene utilizzato per ottenere l’estratto grezzo?
o RNAsi 0,5M
o Fosfato
o Tampone di lisi
o Imidazolo
Tampone di lisi
Quale scopo ha avuto la centrifugazione durante il lab?
o Promuovere la lisi cellulare
o Recuperare proteine secrete dalla cellula
o Miscelare opportunamente la soluzione di cellule
o Separare la frazione solubile da quella insolubile
Separare la frazione solubile da quella insolubile
Definisci l’attività sperimentale di biochimica:
o Purificare e determinare l’attività enzimatica di una proteina
o Determinare l’attività enzimatica di una proteina con diversi substrati
o Purificazione e determinazione della struttura della proteina
o Determinazione della struttura 3° di una proteina, e la sua attività enzimatica
Purificare e determinare l’attività enzimatica di una proteina
Il gradiente discontinuo di imidazolo viene usato per:
o Rompere la membrana cellulare
o Eluire la proteina purificata dalla colonna
o Ottenere l’estratto grezzo
o Lavare la colonna
Eluire la proteina purificata dalla colonna.
Il picco/volume escluso, è costituito da:
o Eluati
o Proteine che non si legano alla colonna
o PNPasi
o PNPasi e proteine che non si legano alla colonna
Proteine che non si legano alla colonna.
Quale di queste tecniche è comunemente usata per il dosaggio proteico:
o SDS-PAGE elettroforesi
o Metodo di Bradford
o Cromatografia ad affinità
o Western blot
Metodo di Bradford
Il reattivo di Bradford contiene:
o Fosfato
o Imidazolo
o Coomassie Brilliant Blue
o BSA
Coomassie Brilliant Blue
Il reattivo di Bradford reagisce con:
o His-tag
o Imidazolo
o Proteine in soluzione
o SDS aggiunto al campione
Proteine in soluzione
Il metodo di Bradford è:
o Lineare a qualsiasi concentrazione
o Parabolico
o Lineare da 10 a 100 microgrammi di proteina
o Lineare in breve intervallo di concentrazioni
Lineare in breve intervallo di concentrazioni
La migrazione delle proteine nell’SDS-PAGE permette di determinare:
o Lunghezza della sequenza aa della proteina
o Carica superficiale della proteina
o MM della proteina
o Idrofobicità della sequenza aa della proteina
Mm
Nel Western blot l’Ab 2° riconosce specificamente:
o Il latte usato per saturare
o L’Ab 1° specie-specifico
o La proteina trasferita su filtro
o L’SDS
L’Ab 1^ specie -specifico
La determinazione sperimentale della Km richiede:
o Misure di v a concentrazione saturante di substrato
o Misure di velocità a diverse concentrazioni di substrato
o Conoscenza esatta della concentrazione di enzima nelle miscele di reazione usate per misurare la v
o Misure di v a diverse concentrazioni di enzima
Misure di velocità a diverse concentrazioni di substrato.
Il grafico dei doppi reciproci:
o Ha pendenza tanto maggiore quanto maggiore la vmax
o Ha intercetta sulle ascisse uguale a Km/vmax
o Ha intercetta sulle ascisse indipendente da vmax
o Ha pendenza indipendente da Km
Ha intercetta sulle ascisse indipendente da Vmax
Cosa si intende per saggio accoppiato di attività enzimatica?
o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima saturante
o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima il cui prodotto non è spettrofotometricamente misurabile
o Un metodo di dosaggio in cui si segue direttamente la reazione catalizzata dall’enzima in esame
o Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima limitante
Un metodo di dosaggio con cui si segue la reazione catalizzata dell’enzima in esame utilizzando una seconda reazione catalizzata da un enzima saturante
L’unità di misura della vmax è:
o Mg min -1
o mM min-1
o mM min
o mg min-1
mM/ min
A concentrazioni di substrato saturante:
o La v di reazione è semimassimale
o La v di reazione varia al variare della concentrazione di enzima
o La v di reazione non varia al variare della concentrazione di enzima
o La reazione ha raggiunti l’equilibrio
La V di reazione varia al variare della concentrazione di enzima.
Come si calcola l’indice di purificazione?
o Rapporto tra attività enzimatica U/ml di ciascun passaggio di purificazione, e quella del 1°
o Rapporto tra attività specifica U/mg di ciascun passaggio, e quella del 1°
o Rapporto tra attività specifica U/mg di ciascun passaggio, e quella del 1° , moltiplicando x100
o Rapporto tra concentrazione proteica mg/ml di ciascun passaggio, e quella del 1°
Rapporto tra attività specifica U/mg si ciascun passaggio, e quella del 1°
Quale di queste è una tecnica comunemente usata per purificare le proteine:
o Western blot
o Cromatografia di affinità
o Metodo di Bradford
o HPLC
Cromatografia di affinità.
Il numero di molecole del reattivo di Bradford è proporzionale a:
o Volume della soluzione aggiunta
o Numero di proteine presenti in soluzione
o Imidazolo in soluzione
o pH della soluzione
Numero di proteine presenti in soluzione.
Il detector dello spettrofotometro misura.
o La luce assorbita
o L’intensità della luce incidente
o L’intensità della luce trasmessa
o La velocità di reazione
L’intensità della luce trasmessa
L’SDS-PAGE avviene:
o A pH 4
o A pH 10
o In condizioni denaturanti
o In condizioni non denaturanti
In condizioni denaturanti.
Quale di queste affermazioni è vera?
o pH stacking gel > pH running gel
o pH stacking = pI della proteina di interesse
o pH stacking < pH running
o pH stacking = pH running
PH stacking<pH running
Il sodio dodecilfosfato, SDS, è:
o Il substrato della reazione catalizzata da PNPasi
o Il colorante reattivo di Bradford
o Una molecola anfifilica che si lega alle proteine
o Un tampone
Una molecola anfifilica che si lega alle proteine.
Il molecular weight marker usato in SDS-PAGE è composto da:
o Sodio dodecil fosfato a diverse concentrazioni
o Miscela di proteine incognite
o Glicerolo a diverse concentrazioni
o Miscela di proteine note
Miscela di proteine note.
L’unità di misura della Km è una concentrazione in:
o mM-1
o mM
o mg/ml
o U
mM
La Km:
o Varia al variare della concentrazione di enzima
o Più è elevata, minore è la concentrazione di substrato necessaria per saturare l’enzima
o Ha le unità di misura della concentrazione
o È pari alla velocità di reazione quando l’enzima è semisaturo
Ha le unità di misura della concentrazione
Assorbanza e concentrazione sono legate tra loro dalla:
o Equazione di Michaelis e Menten
o K
o Vmax
o Legge di Lambert-Beer
Legge di Lambert-Beer
Il filtro di nitrocellulosa nel Western blot serve a:
o Quantificare le proteine separate sul gel
o Calcolare la massa molecolare delle proteine
o Separare le proteine in base alla massa molecolare
o Trasferire le proteine separate tramite elettroforesi
Trasferire le proteine separate tramite elettroforesi.
Nel western blot le proteine sul filtro di nitrocellulosa si legano a:
o Fluoro foro
o Ab 2°
o Ab specifico
o Fosfato
Ab specifico.
Un enzima è definito come una proteina che:
o Accelera solo la reazione diretta
o Accelera solo la reazione inversa
o Viene modificata al termine della reazione
o Accelera la reazione stabilizzando lo stato di transizione
Accelera la reazione stabilizzando lo stato di transizione.
Come si calcola l’attività specifica di un enzima?
o Unità totali di enzima / concentrazione della proteina
o Mg di proteina del campione x volume del campione
o Unità di enzima del campione x volume del campione
o Unità totali di enzima / quantità totale di proteine in mg
Unità totali di enzima/quantità totale di proteine in mg
Disporre in ordine di esecuzione le seguenti fasi della purificazione IMAC:
- Eluizione
- Impaccamento
- Caricamento del campione
- Equilibrazione
- Lavaggio
2-4-3-5-1
Impaccamento - equilibrazione - Caricamento del campione - Lavaggio - Eluizione
L’attività enzimatica della PNPasi viene tipicamente monitorata attraverso:
- La misura del peso molecolare dell’enzima
- L’assorbimento spettroscopico dell’enzima
- L’emissione di fluorescenza dell’enzima
- L’assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione
L’assorbimento spettroscopico di un prodotto di reazione.
Come si calcola la resa di una purificazione?
- Calcolando il rapporto tra le unità totali di enzima (U) di ciascun passaggio e quelle del primo passaggio
- Calcolando il rapporto tra l’attività enzimatica (U/ml) di ciascun passaggio e quella del primo passaggio e moltiplicando per 100
- Calcolando il rapporto tra le unità totali (U) di enzima di ciascun passaggio di purificazione e quelle del primo passaggio e moltiplicando per 100
- Calcolando il rapporto tra l’attività specifica (U/mg) di ciascun passaggio e quella del primo passaggio e moltiplicando per 100
Calcolando il rapporto tra le unità totali (U) di enzima di ciascun passaggio di purificazione e quelle del primo passaggio e moltiplicando per 100
Durante la purificazione per affinità la fase di impaccamento serve a:
- caricare l’estratto grezzo in colonna
- Raccogliere il picco escluso
- Allontanare tutte le proteine che si sono legate debolmente alla resina
- collocare la fase stazionaria all’interno della colonna cromatografica
Collocare la fase stazionaria all’interno della colonna cromatografica.
