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Mibi > bakterielle Genetik > Flashcards

bakterielle Genetik Flashcards

1
Q

Bakterien als Modelsystem der Genetik

A

Schnelle Generationszeit, klonales Wachstum

Leicht zu kultivieren

Verfügbarkeit genetischer (Plasmide, Phagen, Transposons) und biochemischer Werkzeuge

Genomsequenz ist bekannt

Haploides Genom

Keine Introns

Operone

Viele Individuen -> Detektion seltener Mutationsereignisse

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2
Q

Mutation (Def.)

A

= eine spontan auftretende, dauerhafte Veränderung des Erbguts

Spontane Mutation (z.B. durch Fehler in der Replikation)

Induzierte („erzeugte“) Mutation (z.B. durch UV-Strahlen, also im Labor) -> Mutante = Zelle/Stamm, wessen Genotyp vom parentalen Ausgangsstamm abweicht

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3
Q

Wildtyp (Def.)

A

= natürlich vorkommender Stamm, welcher aus der Umwelt isoliert wurde

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4
Q

Mutante (Def.)

A

= Zelle/Stamm, wessen Genotyp vom parentalen Ausgangsstamm abweicht

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5
Q

Mutation durch Verschiebung des Leserahmens

A

-> Entstehung von anderen Codons

Insertion = der DNA wurde eine Base hinzugefügt

Deletion = die DNA hat eine Base zu wenig

Diese Arten von Mutationen haben normalerweise einen Loss- of- Function Phänotyp

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6
Q

Revertant (Def.)

A

Bezeichnung für die bei der Charakterisierung von Mutanten auftretenden
Organismen oder Stämme, die spontan oder durch geeignete experimentelle
Verfahren wieder den ursprünglichen Phänotyp aufweisen

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7
Q

2 verschiedene Varianten von Revertanten

A

Same-Site Revertant: Mutation ist an derselben Seite wie die organale
Mutation

Second-Site Rvertant: Mutation ist an der anderen Seite der DNA (werden
auch Suppressormutationen genannt)

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8
Q

von DNA zu Wildtyp

A

DNA -> DNA- Replikation -> Transkription von DNA zu mRNA -> Translation der mRNA zu einem Protein -> Protein -> Wildtyp

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9
Q

von DNA zu verschiedenen Arten von Mutationen

A

DNA -> Mutation -> keine normale Replikation der DNA, folgende Varianten

  1. -> BP am Anfang eines Triplets werden vertauscht -> fehlerhafte mRNA -> Translation -> fehlerhaftes Protein = Missense- Mutation
  2. -> BP am Ende eines Triplets werden vertauscht -> fehlerhafte mRNA (z.B. UAG = Stoppcodon) -> Translation -> unvollständiges Protein = Nonsense- Mutation
  3. BP wird komplett geändert -> veränderte mRNA -> Translation -> normales Protein = stille Mutation
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10
Q

Isolation von Mutanten

A

Übernacht Zellkultur in reichem Medium (ohne Antibotika)

  • > 0,1 ml wird in Petrischale mit reichem Medium ohne Antibiotika gegeben (flächendeckender Wachstum = bilden einen Nährboden)
  • > 0,1 ml wird in Petrischale mit reichem Medium und Antibiotika gegeben (nur wenige Bakterien bilden Kolonien)

Bakterien in der 2. Petrischale sind mutiert und so immun gegen das Antibiotikum

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11
Q

Arten von Mutanten

A

-> Unterscheidung nach Phänotyp (Morphologie, Biochemie, Verhalten, Resistenz)

Letale Mutationen

Konditional-letale Mutationen

Loss-of-function-Mutationen

Gain-of-function-Mutation

Neutrale Mutation

Stille Mutation

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12
Q

Letale Mutationen

A

Sind Mutationen, die nach ihrem Auftreten einen Organismus unabhängig
von seiner jeweiligen Lebensphase in jedem Falle töten

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13
Q

Konditional-letale Mutationen

A

Sind Mutationen, deren Veränderung des Genprodukts einen Organismus nur bei bestimmten Wachstumsbedingungen tötet

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14
Q

Loss-of-function-Mutationen

A

Hierbei wird das Genprodukt durch eine Mutation im Gen funktionslos

Ist der Funktionsverlust vollständig, spricht man von Nullallel oder einem
amorphen Allel

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15
Q

Gain-of-function-Mutation

A

Hierbei gewinnt das Gen an Aktivität

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16
Q

Neutrale Mutation

A

Können den Phänotyp verändern, haben aber keine Fitnesskonsequenzen

17
Q

Stille Mutation

A

Sind Mutationen, bei denen das gebildete Protein unverändert bleibt

Dabei kann unterschiedliche Faltung die Menge des gebildete Protein
beeinflussen

18
Q

Wie werden Mutanten gefunden?

A

Selektion: Bedingung, welche das Wachstum der gesuchten Mutanten begünstigen (z. B.
Antibiotikaresistenz)

Screen: Individuen werden auf die gesuchte Mutation untersucht

19
Q

Um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden:

A

o Stempeltechnik zum Nachweis von Mutanten mit spezifischem
Nährstoffbedarf
o Vereinfachung der Screen-Methode, da man viele Kolonien untersucht
o Alle Kolonien werden auf Agarplatten verteilt, auf jeder Agarplatte sind ca. 200 Kolonien (= Masterplatten)
o 2 Replikaplatten von jeder Masterplatten, einmal mit Minimalmedium und
einmal mit Vollmedium
o Vergleicht man Ergebnis der Replikaplatten mit Voll- und Minimalmedium, sieht man Mutanten wachsen nur auf Vollmedium
o Da das Koloniemuster bei den Replikaplatten erhalten bleibt, also bei Voll- und
Minimalmedium gleich ist, sieht man bei einem Vergleich auch, welche Kolonien mutiert sind (diese Kolonien fehlen auf der Platte mit dem Minimalmedium)

20
Q

Luria-Delbrück-Experiment (Fluktuationstest)

A
  • Es wurden E.Coli und Bakteriophagen von E.Coli benutzt
  • E.Coli kann Mutation entwickeln, die Bakteriophagen davon abhalten E.Coli abzutöten
  • Vorgehensweise:
  • 3 unterschiedliche Ansätze mit E.Coli Kolonien
  • Bakterien wachsen, Bakterien erst ab dritten Generation der Selektion (Phagen) ausgesetzt
  • 2 unterschiedliche Hypothesen untersucht
21
Q

Welche 2 Hypothesen wurden bei Luria- Delbrück untersucht und was war das Ergebnis?

A

Adaptive Immunitätshypthese (auf Selektion folgt Mutation)
o Es müssten am Ende von allen drei Ansätzen ähnlich viele Kolonien/
Bakterien vorhanden sein

Random Mutationshypothese (zufällige Mutationen -> Mutation schon vor Selektion)
o Mutationen passieren zufällig irgendwann während des Wachstums
-> hohe Varianz der Endkolonien zwischen allen drei Ansätzen
-> es gibt eine „Jackpot“-Kolonie = frühe Mutation, alle weiteren Generationen haben auch diese Mutation -> viele Bakterien

Ergebnis des Experiments: Hohe Varianz -> Random Mutationshypothese
bestätigt

22
Q

Replica- Plating (Stempeltechnik)

A
  • Man drückt eine Masterplatte (Petrischale mit Kolonien) auf einen Stempel mit einem sterilem Tuch
  • Dann werden Replikapetrischalen ebenfalls auf den Stempel gedrückt
  • Nach erneuter Inkubation wachsen auf den Replikaplatten auch Kolonien, da durch den 1.
    Schritt Bakterien auf das Tuch übertragen wurden
  • Das originale Muster der Kolonien bleibt erhalten
  • Mit der Repikaplatte kann man, dann einzelne Kolonien untersuchen
23
Q

Lederberg Experiment

A

Stempeltechnik: die Masterplatte hatte ein konfluentes Wachstum, die hat man auf den
Replikasstempel gegeben und verschiedene Replikaplatten (alle mit demselben
Selektionsstress z.B. Antibiotika) daraus erstellt

Nach einer Übernachtinkubation hatten alle Platten dasselbe Muster der Kolonienverteilung -> Mutationen waren schon in der Masterplatte vorhanden, sind als nicht durch
Selektionsstress entstanden, sondern zufällig/spontan

24
Q

Techniken der bakteriellen Genetik

A

Methoden des Gentrasfers:

  • Transformation
  • Transduktion
  • Konjugation: Plasmidübertragung/ Chromosomenübertragung

homologe Rekombination

Zwei- Faktoren- Kreuzung (Entfernung von zwei Mutationen bestimmen)

drei- Faktoren- Kreuzung (Bestimmung der Orientierung/ Reihenfolge von Genen)

Konjugation

Transposition

25
Q

Transformation

A
  • DNA wird von einer Spenderzelle freigesetzt, DNA wird durch einen
    Mechanismus von der Empfängerzelle aufgenommen und kann dort zu neuen Informationen führen
  • Beruht auf die homologe Rekombination
  • Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien
26
Q

Transduktion (DNA-Übertragung mit Bakteriophagen)

A
  • Bakteriophage lysiert die Spenderzelle und manche der Bakteriophagenpartikel tragen dann die DNA der Spenderzelle in die
    Empfängerzelle
  • Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien mithilfe von Bakteriophagen
    o Bakteriophage bindet an einen Rezeptor und injiziert DNA -> DNA-Replikation
    o Phagen DNA vermehrt sich, Wirts- DNA wird zerstückelt, aber die DNA zuschneidenden
    Proteine schneiden auch manchmal fälschlicherweise Wirts- DNA, welche dann auch in den Phagenköpfen verpackt werden (= transduzierende Partikel)
    o Phagen nutzen bakteriellen biosynthetischen Ressourcen um sich zu vermehren
    -> Zelllyse und der Zyklus fängt vom Neuen an
27
Q

Konjugation: Plasmidübertragung/ Chromosomenübertragung

A
  • Plasmide oder Teile des Chromosoms werden durch eine spezielle
    Konjugationsmaschinerie (von Bakterium zu Bakterium)
  • Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien über F-Plasmid
    o Es wird durch eine Transferregion ein Pilus ausgebildet (von einer F+ Zelle zu einer FZelle,
    F+ hat ein F-Plasmid)
    o Pilus zieht entweder Donor an Recipient oder Pilus überträgt DNA
    o Pilus kodiert aus der tra-Region des F-Plasmids (oriT =Start der Ablesung der DNA)
    o Übertragung der DNA auch hier einzelsträngig
    o F-Plasmid wird in F- Zelle (Recipient) nach Übertragung neu synthetisiert
28
Q

Homologe Rekombination

A

o Homologe DNA- Moleküle (RecA, SSB- Protein) paaren und tauschen DNA- Teilstücke
aus
o Der Mechanismus läuft durch das Brechen und Wiederzusammenfügen gepaarter Teilstücke ab (Doppelstrang/ Einzelstrang)
o Die Paarung kann über Hunderte oder Tausende von Basen stattfinden
o Die Auflösung erfolgt durch Schneiden und Verknüpfung der quervernetzten DNAMoleküle
o Wichtig: es gibt zwei mögliche Ergebnisse, je nachdem, wo die Stränge während des
Auflösungsvorgangs geschnitten werden

29
Q

Zwei- Faktoren- Kreuzung (Entfernung von zwei Mutationen bestimmen)

A

o Man benutzt eine Donorzelle (ohne Mutation A+, B+) und eine Recipientenzelle (mit
Mutation A-, B-)
o Man infiziert die Donorzelle mit Bakteriophagen und man transduciert dann die
transducierenden Partikel (je mit unterschiedlichen Teilen der Donor- DNA) in die
Recipientenzelle
o Es findet homologe Rekombination statt -> es entstehen folgende Möglichkeiten: A+B+, A+B-, A-B+, A-B-
o Selektion auf einen bestimmten Marker (z.B. A+)
o Dann wird ein Screen gemacht und man schaut, welche der transducierten Zellen auch B+ sind (im diesem Beispiel)
o Dadurch kann man eine gewissen Frequenz herausfinden -> Frequenz der Cotransduction
o Frequenz mathematisch errechnen c = (1 - d/L)^3
L= Kapazität Phagenkopf, d= Distanz zweier Gene

30
Q

Drei- Faktoren- Kreuzung (Bestimmung der Orientierung/ Reihenfolge von Genen)

A

o In diesem Fall drei Marker (A, B, C je +/-)
o Man selektiert auf einen der Marker (hier A+) und screened dann ob B+ und C+
übertragen wurden (also B- und C- ersetzt wurden)
o folgende möglichen Kombinationen: A+B+C+, A+B+C-, A+B-C-, A+B-C+
o Ziel des Experiments: Was ist das seltenste Ereignis
o Wenn man das festgestellt hat, weiß man welcher dieser Marker in der Mitte zu
finden ist

31
Q

Transposition = das Einfügen eines transponierbaren Elements führt zur Verdoppelung der
Zielsequenz (kodiert von tnp)

A 
o Funktionsweise: bei der Ziel- DNA ist eine bestimmte Basenpaar-Sequenz, die
erkannt wird (von Transporase), das transponierbare Element (Transposon) wird in
die Zielsequenz eingefügt, wobei die Zielsequenz verdoppelt wird
o Transposon = ist ein DNA-Abschnitt, der seine Position im Genom verändern kann
32
Q

Prinzip der Transformation

A

DNA-bindende Transportproteine in der Membran machen DNA
einzelsträngig

RecA-Protein um die homologe Kombination in das Genom zu vermitteln

Man unterscheidet zwischen zwei Bakterien nach der Fähigkeit DNA
aufzunehmen -> natürlich und chemisch kompetent

33
Q

Transformation am Bsp. Mäuse

A

o Lebende glatte S- Zellen besitzen eine Kapsel und töten Mäuse, werden diese Zellen durch Hitze abgetötet, töten sie keine Mäuse
o Lebende raue R- Zelle (Mutation von S-Zellen) besitzen keine Kapsel -> Maus lebt
o Werden Mäuse mit lebenden R-Zellen mit abgetötete S-Zellen infiziert, wird die DNA
der S- Zellen in die R-Zellen transformiert und die R-Zellen können wieder eine Kapsel ausbilden, sodass die Mäuse sterben

34
Q

Allgemeine Transduktion

A
  • Beliebiger Teil des Chromosoms wird zufällig in die Phagenköpfe verpackt ->
    transduzierender Partikel
  • Es wird also ein beliebiger Teil des Chromosoms in das Zielbakterium übertragen
  • Nur einbruchteil der transduzierten Partikel tragen die Wirts- DNA
35
Q

Man unterscheidet zwei Mechanismen bei der Transposition:

A

Konservative Transposition:
Transposon wird von der ursprünglichen Spender- DNA ausgeschnitten und in die Zielsequenz eingebaut

Replikative Transposition:
-Transposition wird während des Transpositionsschrittes repliziert und man hat
dann sowohl in der Spender- DNA als auch in der Ziel- DNA eine Kopie des Transposons

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