bakterielle Genetik Flashcards
Bakterien als Modelsystem der Genetik
Schnelle Generationszeit, klonales Wachstum
Leicht zu kultivieren
Verfügbarkeit genetischer (Plasmide, Phagen, Transposons) und biochemischer Werkzeuge
Genomsequenz ist bekannt
Haploides Genom
Keine Introns
Operone
Viele Individuen -> Detektion seltener Mutationsereignisse
Mutation (Def.)
= eine spontan auftretende, dauerhafte Veränderung des Erbguts
Spontane Mutation (z.B. durch Fehler in der Replikation)
Induzierte („erzeugte“) Mutation (z.B. durch UV-Strahlen, also im Labor) -> Mutante = Zelle/Stamm, wessen Genotyp vom parentalen Ausgangsstamm abweicht
Wildtyp (Def.)
= natürlich vorkommender Stamm, welcher aus der Umwelt isoliert wurde
Mutante (Def.)
= Zelle/Stamm, wessen Genotyp vom parentalen Ausgangsstamm abweicht
Mutation durch Verschiebung des Leserahmens
-> Entstehung von anderen Codons
Insertion = der DNA wurde eine Base hinzugefügt
Deletion = die DNA hat eine Base zu wenig
Diese Arten von Mutationen haben normalerweise einen Loss- of- Function Phänotyp
Revertant (Def.)
Bezeichnung für die bei der Charakterisierung von Mutanten auftretenden
Organismen oder Stämme, die spontan oder durch geeignete experimentelle
Verfahren wieder den ursprünglichen Phänotyp aufweisen
2 verschiedene Varianten von Revertanten
Same-Site Revertant: Mutation ist an derselben Seite wie die organale
Mutation
Second-Site Rvertant: Mutation ist an der anderen Seite der DNA (werden
auch Suppressormutationen genannt)
von DNA zu Wildtyp
DNA -> DNA- Replikation -> Transkription von DNA zu mRNA -> Translation der mRNA zu einem Protein -> Protein -> Wildtyp
von DNA zu verschiedenen Arten von Mutationen
DNA -> Mutation -> keine normale Replikation der DNA, folgende Varianten
- -> BP am Anfang eines Triplets werden vertauscht -> fehlerhafte mRNA -> Translation -> fehlerhaftes Protein = Missense- Mutation
- -> BP am Ende eines Triplets werden vertauscht -> fehlerhafte mRNA (z.B. UAG = Stoppcodon) -> Translation -> unvollständiges Protein = Nonsense- Mutation
- BP wird komplett geändert -> veränderte mRNA -> Translation -> normales Protein = stille Mutation
Isolation von Mutanten
Übernacht Zellkultur in reichem Medium (ohne Antibotika)
- > 0,1 ml wird in Petrischale mit reichem Medium ohne Antibiotika gegeben (flächendeckender Wachstum = bilden einen Nährboden)
- > 0,1 ml wird in Petrischale mit reichem Medium und Antibiotika gegeben (nur wenige Bakterien bilden Kolonien)
Bakterien in der 2. Petrischale sind mutiert und so immun gegen das Antibiotikum
Arten von Mutanten
-> Unterscheidung nach Phänotyp (Morphologie, Biochemie, Verhalten, Resistenz)
Letale Mutationen
Konditional-letale Mutationen
Loss-of-function-Mutationen
Gain-of-function-Mutation
Neutrale Mutation
Stille Mutation
Letale Mutationen
Sind Mutationen, die nach ihrem Auftreten einen Organismus unabhängig
von seiner jeweiligen Lebensphase in jedem Falle töten
Konditional-letale Mutationen
Sind Mutationen, deren Veränderung des Genprodukts einen Organismus nur bei bestimmten Wachstumsbedingungen tötet
Loss-of-function-Mutationen
Hierbei wird das Genprodukt durch eine Mutation im Gen funktionslos
Ist der Funktionsverlust vollständig, spricht man von Nullallel oder einem
amorphen Allel
Gain-of-function-Mutation
Hierbei gewinnt das Gen an Aktivität
Neutrale Mutation
Können den Phänotyp verändern, haben aber keine Fitnesskonsequenzen
Stille Mutation
Sind Mutationen, bei denen das gebildete Protein unverändert bleibt
Dabei kann unterschiedliche Faltung die Menge des gebildete Protein
beeinflussen
Wie werden Mutanten gefunden?
Selektion: Bedingung, welche das Wachstum der gesuchten Mutanten begünstigen (z. B.
Antibiotikaresistenz)
Screen: Individuen werden auf die gesuchte Mutation untersucht
Um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden:
o Stempeltechnik zum Nachweis von Mutanten mit spezifischem
Nährstoffbedarf
o Vereinfachung der Screen-Methode, da man viele Kolonien untersucht
o Alle Kolonien werden auf Agarplatten verteilt, auf jeder Agarplatte sind ca. 200 Kolonien (= Masterplatten)
o 2 Replikaplatten von jeder Masterplatten, einmal mit Minimalmedium und
einmal mit Vollmedium
o Vergleicht man Ergebnis der Replikaplatten mit Voll- und Minimalmedium, sieht man Mutanten wachsen nur auf Vollmedium
o Da das Koloniemuster bei den Replikaplatten erhalten bleibt, also bei Voll- und
Minimalmedium gleich ist, sieht man bei einem Vergleich auch, welche Kolonien mutiert sind (diese Kolonien fehlen auf der Platte mit dem Minimalmedium)
Luria-Delbrück-Experiment (Fluktuationstest)
- Es wurden E.Coli und Bakteriophagen von E.Coli benutzt
- E.Coli kann Mutation entwickeln, die Bakteriophagen davon abhalten E.Coli abzutöten
- Vorgehensweise:
- 3 unterschiedliche Ansätze mit E.Coli Kolonien
- Bakterien wachsen, Bakterien erst ab dritten Generation der Selektion (Phagen) ausgesetzt
- 2 unterschiedliche Hypothesen untersucht
Welche 2 Hypothesen wurden bei Luria- Delbrück untersucht und was war das Ergebnis?
Adaptive Immunitätshypthese (auf Selektion folgt Mutation)
o Es müssten am Ende von allen drei Ansätzen ähnlich viele Kolonien/
Bakterien vorhanden sein
Random Mutationshypothese (zufällige Mutationen -> Mutation schon vor Selektion) o Mutationen passieren zufällig irgendwann während des Wachstums -> hohe Varianz der Endkolonien zwischen allen drei Ansätzen -> es gibt eine „Jackpot“-Kolonie = frühe Mutation, alle weiteren Generationen haben auch diese Mutation -> viele Bakterien
Ergebnis des Experiments: Hohe Varianz -> Random Mutationshypothese
bestätigt
Replica- Plating (Stempeltechnik)
- Man drückt eine Masterplatte (Petrischale mit Kolonien) auf einen Stempel mit einem sterilem Tuch
- Dann werden Replikapetrischalen ebenfalls auf den Stempel gedrückt
- Nach erneuter Inkubation wachsen auf den Replikaplatten auch Kolonien, da durch den 1.
Schritt Bakterien auf das Tuch übertragen wurden - Das originale Muster der Kolonien bleibt erhalten
- Mit der Repikaplatte kann man, dann einzelne Kolonien untersuchen
Lederberg Experiment
Stempeltechnik: die Masterplatte hatte ein konfluentes Wachstum, die hat man auf den
Replikasstempel gegeben und verschiedene Replikaplatten (alle mit demselben
Selektionsstress z.B. Antibiotika) daraus erstellt
Nach einer Übernachtinkubation hatten alle Platten dasselbe Muster der Kolonienverteilung -> Mutationen waren schon in der Masterplatte vorhanden, sind als nicht durch
Selektionsstress entstanden, sondern zufällig/spontan
Techniken der bakteriellen Genetik
Methoden des Gentrasfers:
- Transformation
- Transduktion
- Konjugation: Plasmidübertragung/ Chromosomenübertragung
homologe Rekombination
Zwei- Faktoren- Kreuzung (Entfernung von zwei Mutationen bestimmen)
drei- Faktoren- Kreuzung (Bestimmung der Orientierung/ Reihenfolge von Genen)
Konjugation
Transposition
Transformation
- DNA wird von einer Spenderzelle freigesetzt, DNA wird durch einen
Mechanismus von der Empfängerzelle aufgenommen und kann dort zu neuen Informationen führen - Beruht auf die homologe Rekombination
- Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien
Transduktion (DNA-Übertragung mit Bakteriophagen)
- Bakteriophage lysiert die Spenderzelle und manche der Bakteriophagenpartikel tragen dann die DNA der Spenderzelle in die
Empfängerzelle - Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien mithilfe von Bakteriophagen
o Bakteriophage bindet an einen Rezeptor und injiziert DNA -> DNA-Replikation
o Phagen DNA vermehrt sich, Wirts- DNA wird zerstückelt, aber die DNA zuschneidenden
Proteine schneiden auch manchmal fälschlicherweise Wirts- DNA, welche dann auch in den Phagenköpfen verpackt werden (= transduzierende Partikel)
o Phagen nutzen bakteriellen biosynthetischen Ressourcen um sich zu vermehren
-> Zelllyse und der Zyklus fängt vom Neuen an
Konjugation: Plasmidübertragung/ Chromosomenübertragung
- Plasmide oder Teile des Chromosoms werden durch eine spezielle
Konjugationsmaschinerie (von Bakterium zu Bakterium) - Übertragung von genetischer Information zwischen Bakterien über F-Plasmid
o Es wird durch eine Transferregion ein Pilus ausgebildet (von einer F+ Zelle zu einer FZelle,
F+ hat ein F-Plasmid)
o Pilus zieht entweder Donor an Recipient oder Pilus überträgt DNA
o Pilus kodiert aus der tra-Region des F-Plasmids (oriT =Start der Ablesung der DNA)
o Übertragung der DNA auch hier einzelsträngig
o F-Plasmid wird in F- Zelle (Recipient) nach Übertragung neu synthetisiert
Homologe Rekombination
o Homologe DNA- Moleküle (RecA, SSB- Protein) paaren und tauschen DNA- Teilstücke
aus
o Der Mechanismus läuft durch das Brechen und Wiederzusammenfügen gepaarter Teilstücke ab (Doppelstrang/ Einzelstrang)
o Die Paarung kann über Hunderte oder Tausende von Basen stattfinden
o Die Auflösung erfolgt durch Schneiden und Verknüpfung der quervernetzten DNAMoleküle
o Wichtig: es gibt zwei mögliche Ergebnisse, je nachdem, wo die Stränge während des
Auflösungsvorgangs geschnitten werden
Zwei- Faktoren- Kreuzung (Entfernung von zwei Mutationen bestimmen)
o Man benutzt eine Donorzelle (ohne Mutation A+, B+) und eine Recipientenzelle (mit
Mutation A-, B-)
o Man infiziert die Donorzelle mit Bakteriophagen und man transduciert dann die
transducierenden Partikel (je mit unterschiedlichen Teilen der Donor- DNA) in die
Recipientenzelle
o Es findet homologe Rekombination statt -> es entstehen folgende Möglichkeiten: A+B+, A+B-, A-B+, A-B-
o Selektion auf einen bestimmten Marker (z.B. A+)
o Dann wird ein Screen gemacht und man schaut, welche der transducierten Zellen auch B+ sind (im diesem Beispiel)
o Dadurch kann man eine gewissen Frequenz herausfinden -> Frequenz der Cotransduction
o Frequenz mathematisch errechnen c = (1 - d/L)^3
L= Kapazität Phagenkopf, d= Distanz zweier Gene
Drei- Faktoren- Kreuzung (Bestimmung der Orientierung/ Reihenfolge von Genen)
o In diesem Fall drei Marker (A, B, C je +/-)
o Man selektiert auf einen der Marker (hier A+) und screened dann ob B+ und C+
übertragen wurden (also B- und C- ersetzt wurden)
o folgende möglichen Kombinationen: A+B+C+, A+B+C-, A+B-C-, A+B-C+
o Ziel des Experiments: Was ist das seltenste Ereignis
o Wenn man das festgestellt hat, weiß man welcher dieser Marker in der Mitte zu
finden ist
Transposition = das Einfügen eines transponierbaren Elements führt zur Verdoppelung der
Zielsequenz (kodiert von tnp)
o Funktionsweise: bei der Ziel- DNA ist eine bestimmte Basenpaar-Sequenz, die erkannt wird (von Transporase), das transponierbare Element (Transposon) wird in die Zielsequenz eingefügt, wobei die Zielsequenz verdoppelt wird o Transposon = ist ein DNA-Abschnitt, der seine Position im Genom verändern kann
Prinzip der Transformation
DNA-bindende Transportproteine in der Membran machen DNA
einzelsträngig
RecA-Protein um die homologe Kombination in das Genom zu vermitteln
Man unterscheidet zwischen zwei Bakterien nach der Fähigkeit DNA
aufzunehmen -> natürlich und chemisch kompetent
Transformation am Bsp. Mäuse
o Lebende glatte S- Zellen besitzen eine Kapsel und töten Mäuse, werden diese Zellen durch Hitze abgetötet, töten sie keine Mäuse
o Lebende raue R- Zelle (Mutation von S-Zellen) besitzen keine Kapsel -> Maus lebt
o Werden Mäuse mit lebenden R-Zellen mit abgetötete S-Zellen infiziert, wird die DNA
der S- Zellen in die R-Zellen transformiert und die R-Zellen können wieder eine Kapsel ausbilden, sodass die Mäuse sterben
Allgemeine Transduktion
- Beliebiger Teil des Chromosoms wird zufällig in die Phagenköpfe verpackt ->
transduzierender Partikel - Es wird also ein beliebiger Teil des Chromosoms in das Zielbakterium übertragen
- Nur einbruchteil der transduzierten Partikel tragen die Wirts- DNA
Man unterscheidet zwei Mechanismen bei der Transposition:
Konservative Transposition:
Transposon wird von der ursprünglichen Spender- DNA ausgeschnitten und in die Zielsequenz eingebaut
Replikative Transposition:
-Transposition wird während des Transpositionsschrittes repliziert und man hat
dann sowohl in der Spender- DNA als auch in der Ziel- DNA eine Kopie des Transposons
