Aula Prática 4- EXTRAÇÃO DE DNA Flashcards
Que sentido segue o fluxo da informação genética?
DNA – RNA – proteínas.
Quais as unidades monoméricas dos ácidos nucleicos?
Os nucleótidos.
Quais os 3 componentes característicos de um nucleótido?
- Base nitrogenada
- Açúcar (Pentose)
- Grupo fosfato (PO4-)
Que componente é responsável pela carga global negativa do DNA?
O grupo fosfato.
Quando o DNA estiver desenrolado, quem irá estabilizar a sua carga negativa?
Os iões Mg2+, pois as cargas positivas deste ião ligar-se-ão às cargas negativas do grupo fosfato.
Que bases nitrogenadas apresentam dois anéis?
A Guanina e a Adenina.
O que é a extração do DNA?
É o processo pelo qual o DNA é separado das proteínas, membranas e todo o restante material celular contido no interior da célula.
Que passos estão envolvidos na extração do DNA?
A extração de DNA normalmente envolve 3 passos: 1) lise celular, 2) separação do DNA dos restantes componentes celulares, 3) isolamento do DNA.
Porque é que este processo requer um maneio cuidadoso?
Para evitar a contaminação e o cruzamento de amostras.
Como pode ser feita a lise celular?
A disrupção da membrana celular pode ser realizada através de:
1) aumento da temperatura para que se aumente a fluidez membranar;
2) DTT (ditiotreitol), um agente redutor com capacidade para reduzir as ligações dissulfureto presentes nas proteínas membranares;
3) um detergente como o SDS (dodecil sulfato de sódio) com capacidade para quebrar a membrana celular.
A inativação das proteínas ocorre através do quê?
Da desnaturação pelo calor;
Digestão enzimática (por exemplo proteinase K).
Se quisermos que o DNA seja preservado, isto é não degradado, que cuidados deve se ter ao longo do procedimento?
A temperatura deverá ser mantida abaixo dos 60 ºC e os períodos de incubação não deverão exceder os 15-20 minutos.
De que duas maneiras se pode realizar a separação do DNA dos outros componentes celulares?
Por centrifugação ou através da adição de solventes orgânicos.
Se o DNA for separado recorrendo a solventes orgânicos que fases surgiram?
Duas fases distintas irão surgir:
uma fase orgânica no fundo do tubo;
uma fase aquosa no topo do tubo contendo o DNA.
Neste momento, o DNA pode ser simplesmente retirado com uma pipeta do topo do tubo.
Se for necessário, o DNA poderá ser filtrado e concentrado.
Em que comprimento de onda o DNA tem o seu máximo de absorção?
260 nm.
O que é verificado no final do processo de extração?
O rendimento do DNA obtido e a sua pureza.
Como podemos saber o rendimento do DNA?
Através de leitura de absorvância (Abs) ou com uma eletroforese em gel de agarose.
Para averiguar acerca da pureza do DNA é suficiente medir a sua absorvância nos 260 nm? Porquê?
Não, pois existem outras moléculas que também absorvem nesse comprimento de onda, como o RNA. E outras absorvem na gama do UV também, como proteínas, sais e outros.
Que outras leituras adicionais deverão ser feitas no espectrofotômetro e a que comprimentos de onda?
A deteção de compostos orgânicos, a 230 nm, e a deteção de proteínas, a 280 nm, para que se possa ter uma estimativa mais correta do grau de pureza do DNA extraído.
Para calcular a pureza do DNA após medir leituras adicionais, que cálculos devem ser feitos? E como analisá-los?
As razões de Abs 260/280 e 260/230 irão fornecer um resultado mais fiável relativamente à pureza da amostra. Assim, um DNA puro deverá apresentar os seguintes rácios:
Abs 260/280 = 1,8 – 2,0
Abs 260/230 > ou = 2,0
Que valores demonstram contaminação da amostra por proteínas ou outras substâncias orgânicas?
Se as razões 260/280 e 260/230 forem inferiores aos valores no seguinte intervalo:
Abs 260/280 = 1,8 – 2,0
Abs 260/230 > ou = 2,0
Neste procedimento foi efetuada uma eletroforese, que tipo de gel foi utilizado?
Gel de agarose.
