Aula Prática 1-QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO MÉTODO DE LOWRY Flashcards
Indique uma vantagem do uso do método de Lowry.
Permite detectar concentrações na ordem dos 0,01 mg de proteína/ml.
Este método é baseado em que reações?
O método de Lowry é baseado em 2 reações.
A primeira consiste na redução do ião Cu2+ em condições alcalinas (básicas), formando um complexo com as ligações peptídicas. É denominada de reação de biureto.
A segunda consiste na redução do reagente Folin-Ciocalteau pelo complexo Cobre-ligação peptídica causando uma mudança da coloração para azul forte.
O que possibilita a quantificação espectrofotométrica?
A coloração que as amostras apresentam após a segunda reação.
Explique a vantagem de se recorrer a métodos de Colorimetria neste protocolo.
Permite detetar e quantificar sustâncias que existem em pequenas quantidades numa mistura complexa.
Neste protocolo em que é que se baseia a identificação e quantificação destes proteínas?
No facto de que cada molécula apresentar um espectro de absorção característico.
Explique o significado de cada valor na Lei de Lambert-Beer.
A = ε C l
A é a absorvância da solução a um determinado comprimento de onda.
ε é o coeficiente de absortividade molar (parâmetro característico da substância a um comprimento de onda definido).
l é o percurso ótico (distância percorrida pela luz quando atravessa a amostra), normalmente 1 cm.
C é a concentração da substância que absorve ao comprimento de onda utilizado.
As biomoléculas absorvem luz a comprimentos de onda característicos. Em que comprimentos de onda absorvem os aminoácidos aromáticos?
280 nm.
O Coeficiente de extinção molar, ε , varia com o quê?
Solvente;
Comprimento de onda;
pH.
De acordo com a Lei de Lambert-Bree, a absorvância ou absorção é indiretamente proporcional à concentração da espécie.
Verdadeiro ou Falso?
Falso, é diretamente proporcional (A = ε C l).
Explique de uma forma geral as principais partes e funcionamento de um espectrofotômetro.
Uma fonte de luz (lâmpada) emite luz ao longo de um amplo espectro, então o monocromador seleciona e transmite luz de um determinado comprimento de onda.
A luz monocromática passa através da amostra em uma cuvette e é absorvida pela amostra proporcionalmente à concentração da espécie absorvente.
A luz transmitida é medida por um detector.
Para estimar a concentração da proteína desejada utilizámos uma reta de calibração com outra proteína cuja concentração já era conhecida, a BSA.
Quanto mais proteína existir na amostra, ……… concentrada será a amostra e …….. o valor da sua absorvância.
Mais; maior.
Explique o uso da solução I (NaOH 1M).
Para que o ião Cu2+ seja reduzido, de maneira a formar um complexo de ligações peptídicas (reação de biureto), é necessário que se adicione NaOH 1 M visto que este é um composto alcalino. O cobre tem a capacidade de reduzir o reagente Folin (reacção Folin-Ciocalteau), reação esta que dará uma coloração à solução, permitindo passar à quantificação espectrofotométrica.
Porque é que após adicionar a solução I é necessário ferver a mistura por 5 minutos?
Acelerar a reação ou desnaturar as proteínas.
Porque é que é necessário incubar as amostras longe da luz?
Devido à adição do reagente, as amostras são fotossensíveis.
Porque é que se mede a absorvância a 750 nm?
O composto produzido após as duas reações tem absorvância máxima aos 750 nm.
